中国汉族人群17个心血管疾病易感基因位点基因型和基因频率分析

作者:唐敏,戴勇

    作者单位：重庆医科大学临床检验诊断学，重庆 400016        【摘要】  目的: 调查中国汉族人群中17个心血管疾病易感基因位点的基因型和基因频率. 方法: 运用基因芯片技术同时检测138例来自中国大部分省市的汉族人的13个心血管易感基因的17个SNPs. 结果: 国内未曾见报道的4个基因位点基因型频率分别为： ET2985 AA∶AG∶GG为2.2% (3)∶22.2% (30)∶75.6% (102)；NPRC(-55) AA∶AC∶CC为8.1% (11)∶23.0% (31)∶68.9% (93)；KCNQ1140则只发现了SS基因型；CYP46rs754203 CC∶CT∶TT为55.0％(66)∶20.0%(24)∶25.0%(30). ApoBMsp1 +∶-为92％（232）∶8％（20），而Hapmap公布的则为100％（90）∶0％（0），两者比较，差异有统计学意义（χ2=7.587，P=0.000）. MTHFR677 C∶T为70％（168）∶30％（72），与Hapmap中中国北京汉族人（CHB）公布的结果48.9％（44）∶51.1％（46），以及ALFRED中公布的中国香港汉族（SA0008510）77.8％（322）∶22.2％（92）比较，差异具有统计学意义（χ2和P分别为12.70，0.000； 4.89， 0.027）. 其他位点的调查结果与Hapmap计划中CHB（ANP2238, ApoBXbaⅠ, NOS3298, ApoBEcorⅠ和ApoE112）和ALFRED网站的SA0008510的基因频率（AGT235, ACEAlu, ApoCⅢ3175, ApoCⅢ3206, ApoE158和SerpinA3rs4934）有较好的吻合. 结论：SNPs频率分布具有种族和地区差异，中国汉族人群中ANP2238 C, ApoBEcorⅠ（-）和KCNQ1140 G, 是少见的等位基因（<5%)，可能不是心血管疾病的主要原因. 用基因芯片检测多个心血管疾病易感基因SNPs结果可靠.

   【关键词】  血管疾病 易感基因 单核苷酸多态性 寡核苷酸序列分析

　　0引言

　　目前的研究普遍认为原发性高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉心脏病及脑血管意外等心血管疾病是多因素疾病，是由位于多个易感基因中的多个SNPs微效作用累加，与环境因素相互作用而发病. 不同的SNPs的不同组合，使不同人群具有不同的心血管疾病易患性、导致相应疾病的临床表现各异，治疗效果不同. 因此，对心血管疾病候选基因SNPs的研究是目前心血管疾病研究的热点，研究结果可用于对相关疾病的辅助诊断、治疗方法的选择和预后的估计，更重要的是可以进行易患风险的预测，从而利于疾病的预防. 但是SNPs在不同人群的分布的基因频率有很大的差异，具有种族和地区特色，因此针对不同人群SNPs研究应首先了解SNPs的频率分布情况，挑选该人群中具有一定基因频率的SNPs进行. 本研究我们利用基因芯片技术调查分析中国汉族人群中13个心脑血管疾病相关基因［1-6］的17个SNPs的基因型和基因频率，以了解其在中国汉族人群中的分布特点.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　均来自200504/200609在广东省深圳市人民医院门诊常规体检者，经有关检查除外原发性高血压、冠心病等心血管疾病138(男90，女48)例，平均年龄50.3±10.5岁. 调查对象均为彼此之间无血缘关系汉族，原籍分布中国大部分省份.

　　1.2方法

　　1.2.1标本采集和检测

　　取外周血3 mL, 终浓度为2 g/L的EDTA抗凝，上下颠倒数次混匀，存放于-20℃备用. DNA抽提后，用针对每个SNPs的引物分别进行PCR扩增，混合的PCR产物与基因芯片杂交、显色，最后检测荧光. DNA抽提、PCR扩增、杂交、显色及检测等步骤都严格按照上海百傲公司的Baio基因型检测芯片试剂盒使用说明书进行，芯片用BaiO基因芯片识读仪检测，检测图像经Array Doctor软件分析.

　　1.2.2质量控制对基因芯片检测的准确性，用DNA测序的方法进行了验证，准确率97.8％. 在每次检测中都设置阴性、阳性对照品. 样本检测过程中，若软件对“标志列”、“阴性对照”、“阳性对照”三者进行判断后，输出其中之一为“不合格“，则实验无效. 同时随机抽取一份DNA样品，对其中一些SNP位点进行DNA测序以验证芯片检测准确性.

　　统计学处理：所有资料均以SPSS11.5软件包分析. 基因型和基因频率采用基因计数法计算，调查对象与HardyWeinberg平衡的符合程度采用χ2检验. 组间分析用χ2分析.

　　2结果

　　2.1基因芯片检测和DNA测序

　　基因芯片中包括RAAS系统中的AGT，ACE和内皮细胞功能相关的基因NOS3，ET2，ANP，NPRC和载脂蛋白B，C3和E以及MTHFR，KCNQ1，CYP46A1，SerpinA3等13个基因中17个国内外报道与心血管疾病相关的SNPs. 随机抽取样品进行的DNA测序验证该芯片检测准确性，两者结果吻合（图1，2）.

　　2.2基因型检测

　　结果显示在所调查中国汉族人群中，17个SNPs位点的基因型分布大都符合HardyWeinberg平衡，具有人群代表性（除KCNQ1140位点上未发现有多态性外，81.5％（13/16） SNPs的χ2<χ20.05，1（3.84），P>0.05.

　　2.3基因频率对比分析

　　调查显示中国汉族人群ET2985，NPRC-55 ，CYP46rs754203  的基因型和基因频率（相关报道未见发表）分别为：ET2985的AA，AG和GG基因型频率分别为2.2% (3)，22.2% (30)和75.6% (102)，A等位基因频率为13％，G等位基因频率为87％；NPRC -55的AA, AC和CC基因型频率分别为8.1% (11)，23.0% (31)和68.9% (93)，A等位基因频率为20％，C等位基因频率为80％；CYP46rs754203的CC，CT和TT的基因型频率分别为55.0％(66)，20.0%(24)，25.0%(30)，C的基因频率为65％，而T则为35%；KCNQ1140则只发现了SS基因型. 另一方面调查显示ApoBMsp1 +∶-为92％（232）∶8％（20）；而Hapmap公布的则为100％（90）∶0％（0）；两者比较，差异有统计学意义（χ2=7.587， P=0.00）. 本研究中MTHFR677 C∶T为70％（168）∶30％（72），与Hapmap中国北京汉族人（CHB）公布的结果48.9％（44）∶51.1％（46），以及ALFRED公布的中国香港汉族（SA0008510）77.8％（322）∶22.2％（92）比较，差异具有统计学意义（χ2和P分别为12.70，0.000；4.89，0.027），且后两者之间比较，差异亦有统计学意义（χ2=31.03，P=0.000）. 其他结果则与Hapmap计划中CHB（如ANP2238，ApoBXbaⅠ，ApoBEcorⅠ，ApoE112和SerpinaA3rs4934）及ALFRED网站SA0008510的基因频率（如AGT235，ACEAlu ，NOS3298，ApoCⅢ3175，ApoCⅢ3206和ApoE158）有较好的吻合.

　　3讨论

　　冠心病等多基因疾病，由于发病机制涉及多个系统多种基因，同时检测多个候选基因多个SNPs，较之单独研究某种基因更能发现候选基因之间可能存在的相互作用及微效累积. 从这个出发点，我们利用包含较多心血管疾病易感基因的基因芯片检测中国汉族人群中17个SNPs的基因型，了解这些SNPs在中国人群的频率（尤其是ET2985，NPRC-55和CYP46A1rs754203 3个国内尚未有相关基因型频率检测报道的SNPs），同时验证了基因芯片的检测能力. 为进一步对冠心病等心血管疾病的基因多态性的研究、揭示疾病的发病机制、了解临床表型多样化产生的实质以及进行个体化的临床治疗打下基础.

　本研究我们发现虽然国内外有研究［2-3］报道ANP2238 C，ApoBEcor I（-）对心血管疾病有较大意义，但在中国汉族人群中出现频率较少（<5％），可能不是多因素的心血管疾病的主要原因. 同时检测出中国汉族人群中ET2985A等位基因频率为13％，G为87％；NPRC(-55) A频率为20％，C 80％； CYP46rs754203 C的基因频率为65％，而T则为35%. KCNQ1140则只发现了SS基因型，这与Chen等［5］的研究吻合，即KCNQ1140 G是导致家族性房颤的单基因原因，正常人群中未见有分布.ApoBMsp1和MTHFR677位点的基因频率与中国北京汉族和中国香港人群中的频率差异有统计学意义，可能与人群的选择和检测的例数有关. 其他位点的调查结果与Hapmap计划中CHB（ANP2238，ApoBXbaⅠ，ApoBEcorⅠ，ApoE112和SerpinsA3rs4934）和ALFRED网站SA0008510［7］的基因频率（AGT235，ACEAlu ，NOS3298，ApoCⅢ3175，ApoCⅢ3206和ApoE158）有较好的吻合，结合随机抽样所做的DNA测序结果，证实了基因芯片检测的准确性, 可以用于今后的心血管疾病的相关研究.

【参考文献】  　　［1］Yoshimura M, Yasue H, Nakayama M, et al. A missense glu298asp variant in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm in the Japanese［J］. Hum Genet, 1998,103: 65-69.

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