重复经颅磁刺激对帕金森病鼠纹状体生长相关蛋白和突触素表达的影响

　　作者：王全懂 顾 平 董巧云 王彦永 刘力 王铭维 作者单位：河北医科大学第一医院神经内科 河北省脑老化与认知神经科学重点实验室，河北 石家庄 050017

　　【摘要】目的 探讨重复经颅磁刺激 (repetitive transcranial magnetic，rTMS)对帕金森病(PD)模型鼠纹状体生长相关蛋白(Growth activty protein43，GAP43)和突触素(synaptophysin，p38)表达的影响。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为：对照组，PD模型组，假磁刺激(srTMS)组，rTMS组，每组10只。小鼠皮下注射MPTP(15 mg·kg-1·2 h-1·次-1，注射4次)复制PD模型，rTMS干预，利用免疫组织化学染色技术检测GAP43和p38的表达变化，并借助图像分析系统对其进行定量分析。结果 PD模型组、srTMS组及rTMS组GAP43阳性产物较对照组明显增多，以rTMS组GAP43表达升高最为明显，且着色深，PD模型组和srTMS组校正光密度值(COD)均明显高于对照组(P<0.05)，rTMS组COD显著高于对照组(P<0.01)及PD模型组和srTMS组(P<0.05)。PD模型组和srTMS组及rTMS组p38表达较对照组反应产物明显减少，PD模型组和srTMS组 COD均显著低于对照组(P<0.01)，rTMS组 COD值明显低于对照组(P<0.05),但rTMS组p38表达较PD模型组和srTMS组增多，COD显著高于PD模型组和srTMS组(P<0.05)。结论 rTMS可诱导受损的纹状体区GAP43和p38的表达上调，从而推测rTMS可能通过促进轴突再生和突触重塑，进而对受损的多巴胺转运通路起修补作用，增加多巴胺转运，从而达到治疗作用。

　　【关键词】 重复经颅磁刺激 纹状体 生长相关蛋白 突触素

　　The effect of repetitive transcranial magnetic stimulation on the expressions of growth associated protein43 and synaptophysin in striatum of Parkinson′s disease model mice

　　WANG QuanDong, GU Ping, Dong QiaoYun, et al.

　　Department of Neurology, the First Hospital of Hebei Medical University, Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Provice, Shijiazhuang 050017, Hebei, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on the expressions of growth activity protein (GAP)43 and synaptophysin (p38) in striatum of Parkinson′s disease (PD) model mice. Methods 40 male C57BL/6J mice were randomly divided into control，PD model, sham rTMS, rTMS groups (n=10). The PD model of C57BL/6J mice were made by subcutaneous injection of MPTP solution (15 mg·kg-1·2 h-1) and then were treated with rTMS for 14 days. The GAP43 and p38 expressions in striatum were detected by immunohistochemical method, and the contents of GAP43 and p38 were analyzed by image analysis system. Results The positive reactions of GAP43 apparently increased in striatum of PD, srTMS and rTMS groups, and the corrected optical denstities (COD) were higher significantly than those of control group (PD and srTMS groups(P<0.05), rTMS group(P<0.01). Positive reactions of GAP43 of rTMS group apparently increased comparing with that of PD and srTMS groups, the COD of rTMS group were higher significantly than that of PD and srTMS groups (P<0.05). Positive reactions of p38 apparently decreased in striatum of PD, srTMS and rTMS groups, COD of immunologic reactions of p38 of PD, srTMS and rTMS groups were decreased significantly than that of control group 〔(PD and srTMS groups, P<0.01), (rTMS group P<0.05)〕, but positive reactions of p38 of rTMS group apparently increased than that of PD and srTMS groups, the COD of rTMS group were higher significantly than that of PD and srTMS groups (P<0.05). Conclusions rTMS could upregulate expression of GAP43 and p38 in striatum of PD model mice, may play a role in treating PD by inducing synapse remodeling and subsequent to repair dopamine transport pathway.

　　【Key words】 rTMS; Striatum; Growth activity protein43; Synaptophysin

　　重复经颅磁刺激(rTMS)对帕金森病(PD)症状的改善取得了令人满意的疗效〔1，2〕。但rTMS治疗PD的机制不清，文献报道rTMS可增加纹状体多巴胺含量〔3，4〕。PD患者纹状体内多巴胺含量减少，除黑质多巴胺神经元减少之外，还可能因为多巴胺转运通路中黑质纹状体纤维变性、丢失、突触减少，致使多巴胺无法到达纹状体所致。故诱导黑质纹状体纤维再生和突触重塑以提高多巴胺的转运及释放是PD治疗的理想对策。那么rTMS是否通过诱导黑质纹状体纤维再生和突触重塑以提高多巴胺转运，从而增加纹状体多巴胺含量而发挥治疗作用未见报道。为此本研究检测作为神经重塑可靠探针的GAP43和p38等活性物质表达的变化，以探讨rTMS对神经可塑性的影响，进一步阐明rTMS对PD治疗机制，为临床应用rTMS治疗PD提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　选用8～12 w、体重20～22 g雄性C57BL/6J小鼠40只(由河北医科大学实验动物中心提供)，随机分为：对照组、PD模型组、srTMS组、rTMS组,每组10只。

　　1.2 仪器

　　MagProX100磁刺激治疗仪(丹麦)，Leica2145冰冻切片机(德国)，奥林帕斯光学显微镜(日本)，江苏JD801图像分析系统(南京)。

　　1.3 动物模型复制

　　小鼠背部皮下注射1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)15 mg·kg-1·次-1，连续注射4次，每次间隔2 h,复制急性PD鼠模型。对照组注射生理盐水代替MPTP。

　　1.4 rTMS方法

　　末次注射MPTP 24 h后，将rTMS组动物于清醒状态下置于一长圆形器具中，头部暴露于MagProX100磁刺激治疗仪MC125圆形线圈下,线圈内径10 mm，外径60 mm,最大输出场强3.7T 。线圈距头皮1.5 cm,给予刺激频率为1 Hz，rTMS1组刺激剂量为110%运动阈值(约1T)，rTMS2组刺激强度为130%运动阈值(约1.2T)，刺激25次为一序列，序列间隔2 min，每天刺激5个序列，刺激14 d。srTMS组置于相同环境，但不接受磁刺激。对照组和PD模型组不做处理。

　　1.5 组织固定与免疫组化染色

　　最后一次刺激24 h后，取各组动物，每组10只，于腹腔内注射水合氯醛10%麻醉，经左心室依次灌入生理盐水30 ml，4%多聚甲醛液100 ml(0.5～1 h)，立即取脑并依次浸入15%和30%蔗糖溶液。冷冻后行纹状体冠状切片，厚30 μm。每4张取一张，切片置于含有0.01 mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液中保存，行ABC法进行免疫组织化学染色：将纹状体切片浸入0.3%的甲醇双氧水中10 min;加BSA封闭液;分别将纹状体切片浸入羊抗GAP43(1∶1 000 Santa Cruz)和兔抗p38(1∶200 Chemcon)溶液中;随后依次进入生物素化IgG工作液(北京中山)和SABC三抗工作液(北京中山)，室温下各孵育2 h;辣根过氧化物酶标记的DAB将免疫产物显为棕黄色;免疫组织化学染色后，将切片裱于多聚赖氨酸处理的载玻片上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在孵育过程中用PBS溶液代替一抗做空白对照。

　　1.6 图像分析

　　各组COD值以x±s表示，运用SPSS11.5统计软件，采用方差分析方法进行统计。用光学显微镜观察并确定GAP43、p38免疫反应产物及免疫阳性产物分布部位。应用江苏JD801图像分析系统测定纹状体区免疫阳性产物的光密度值(OD值)，同时测定同一张切片上的胼胝体的OD值作为背景，用GAP43、p38 的OD 值减去胼胝体的OD值作为实际OD (矫正光密度值 COD值)，用COD值进行比较分析，每只动物取三张切片，求平均值。

　　1.7 统计学处理

　　各组COD值以x±s表示，用SPSS11.5统计软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 注射MPTP后动物行为表现

　　对照组动物在注射生理盐水前后，其行为表现无明显差异，MPTP给药组小鼠都出现不同程度的运动障碍，动作迟缓，震颤，竖毛，甚至尿失禁等。对外界刺激反应低下，随着所给MPTP剂量增加，用药时间延长，动物运动障碍程度增加，症状持续时间延长。

　　2.2 rTMS对小鼠纹状体区GAP43表达的影响

　　正常对照组 纹状体区GAP43阳性产物呈环状或点状，淡染，分布稀疏;PD模型组和srTMS组纹状体区可见较多棕黄色环状或点状阳性产物，染色较深，分布较密集;rTMS组纹状体区可见大量棕黄色阳性产物，染色深，分布密集(图1)。COD值比较： rTMS组(0.267 9±0.163 4)显著高于对照组(0.235 0±0.141 2)(P<0.01)以及PD模型组(0.251 9±0.101 5)和srTMS组(0.251 4±0.157 1)(P<0.05);PD模型组和srTMS组显著高于对照组(P<0.05)，PD模型组与srTMS组比较差异无显著性(见图1)。

　　2.3 rTMS对小鼠纹状体区p38表达的影响

　　对照组纹状体区可见大量p38阳性产物，呈点状，深染，分布密集;PD模型组和srTMS纹状体区阳性产物较对照组明显减少，分布稀疏;rTMS组纹状体区可见较多棕黄色点状，分布较密集的阳性产物。免疫产物COD值比较：PD模型组(0.165 2±0.013 6)和srTMS组(0.165 2±0.046 8)较对照组(0.175 1±0.019 0)显著降低(P<0.01);rTMS组(0.169 8±0.025 8)显著低于对照组(P<0.05)，但明显高于PD模型组和srTMS组(P<0.05);rTMS1和rTMS2组无显著差异(见图1)。

　　3 讨 论

　　rTMS是一种无创、无痛、安全的脑刺激手段。rTMS可在深部脑组织产生感应生物电流，从而影响脑神经细胞的功能活动。通过调节频率、强度和刺激间歇、刺激持续时间来影响中枢神经系统的兴奋性,因而对外周及中枢神经系统损伤的疾病具有潜在的治疗作用〔5〕。 1994年Pascual等首先用rTMS治疗PD患者,并获得一定疗效〔6〕,以后这一技术不断更新并应用于临床和实验研究，临床研究发现PD患者经rTMS治疗后其动作反应时间和运动灵活性均有显著改善，临床症状和临床评分均有明显好转〔7，8〕。动物实验表明rTMS对MPTP致大鼠DA系统的损伤有保护作用，使中脑黑质幸存的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性神经元数目增加〔9〕，并引起纹状体多巴胺释放增加〔3，4〕。

　　PD患者纹状体多巴胺含量减少可能是由于黑质纹状体通路中纤维发生变性，丢失，突触减少，致使多巴胺无法到达纹状体所致。所以多巴胺的有效转运依赖于黑质纹状体纤维通路的完整性。孙异临等用MPTP建立亚临床期PD模型，电镜可见PD小鼠纹状体内突触数量明显减少，由此引起多巴胺释放障碍〔10〕。另有研究证实，PD大鼠毁损侧多巴胺能神经元末梢出现萌芽生长，伴有营养轴突血管增生，表明PD早期存在神经改建和重塑〔11〕。故PD患者神经功能的恢复有赖于神经结构的重建。研究显示，脑梗死大鼠rTMS后，大鼠神经功能评分改善，皮质内脑原性神经生长因子表达增多，突触结构改善，促进了神经功能的代偿〔12〕。1998 年，Kolosova 等在动物实验中证实,局部磁刺激可促进神经轴突的再生速度,对恢复伤(术) 后的神经功能具有促进作用〔13〕。胡永善研究显示，经颅磁刺激促进受损周围神经再生和恢复传导功能的作用优于局部电刺激〔14〕。刘传玉证实TMS可促进脑缺血大鼠神经功能的改善,其机制可能与健侧突触超微结构参数的改变有关〔15〕。崔冬生研究表明，磁刺激干预对数生长期的PC12细胞，发现细胞突起增多，细胞外液中多巴胺含量增多〔16〕，可见rTMS有促进神经再生和突触重塑作用。

　　GAP43分布于生长锥和突触前膜，在神经元的生长、新的神经元连接的形成、损伤后突触重塑和再生中起关键作用。是神经元发育和再生的内在决定因素。脑发育和脑损伤后呈现GAP43高表达〔17〕。研究证实，在神经元发育和再生过程中，GAP43沿神经纤维运输并分布于生长锥，在轴突延伸和突触再生过程中GAP43呈现高表达〔18〕，因此生长相关蛋白被认为是神经再塑的可靠的分子探针。本研究结果表明：PD模型组、srTMS组及rTMS组2 w后，纹状体内均见增多的棕黄色点状或环状GAP43阳性产物，推测可能是由于纹状体损伤诱导GAP43表达所致。但rTMS组纹状体内阳性产物明显增多，且染色深，分布密集，COD值明显高于PD 组和srTMS组，提示rTMS可诱导GAP43过表达，依增高的GAP43水平推测rTMS可诱导多巴胺神经元末梢呈现积极的出芽生长。

　　p38是一种突触囊泡蛋白，其数量和密度反映突触数量、突触的转运能力、突触的功能状态，同时又是突触构成的必要蛋白。担负神经递质的包装、储存、调节和释放〔19〕。尤其在钙依赖的神经递质释放中起重要作用。新近突触素作为突触密度的标志物不仅广泛应用于神经轴突末梢和突触的鉴定，而且被公认为是突触发生和突触重塑的重要标志〔20〕。本研究证实：PD模型组和srTMS组及rTMS组与对照组比较，纹状体内突触素免疫反应产物明显减少，阳性产物分布稀疏。其免疫反应产物COD值明显低于对照组(P<0.05)，PD模型组、srTMS及rTMS组纹状体内突触素表达减少可能是黑质纹状体通路中的纤维发生变性，纤维丢失，突触减少所致。但rTMS组与PD模型组及srTMS组比较：rTMS组纹状体内突触素阳性产物明显增多，其免疫反应产物COD值明显高于PD模型组及srTMS组(P<0.05)，表明rTMS组纹状体内突触素表达上调，增加的突触素的水平可能是由于多巴胺能神经元轴突末梢突触囊泡数目增加及纹状体内突触密度增加所致。依上述结果推测rTMS可诱导纹状体区突触数量增多并使突触转运和传递功能呈现活跃状态。

　　rTMS可上调PD模型鼠纹状体内生长相关蛋白和突触素的表达，从而推测rTMS可能通过促进轴突再生和突触重塑，进而对受损的多巴胺转运通路起修补作用，改善多巴胺系统的功能，增加多巴胺释放，达到治疗效果。

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