大鼠局灶脑缺血再灌注后雌二醇的保护作用及其对GDNF表达的影响

　　作者：李昕 王建平 刘春岭 李楠 白宏英 作者单位：郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450014

　　【摘要】目的 探讨大鼠局灶脑缺血再灌注后雌二醇的保护作用及其对胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)表达的影响。方法 用线栓法制作脑缺血再灌注损伤模型。缺血2 h再灌注6、12、24、48 h后断头取脑，应用TTC染色和免疫组化方法，观察脑梗死体积、神经行为学改变及GDNF的表达。结果 与手术对照组相比，雌二醇组神经行为学分值显著降低，脑梗死体积亦显著缩小，在损伤区皮层，雌二醇组GDNF表达明显高于手术对照组，且在再灌注24 h最明显。结论 脑缺血再灌注损伤后雌二醇具有明确的保护作用，可以使GDNF表达增加，雌二醇可能通过上调GDNF的表达而发挥其作用。

　　【关键词】 雌二醇 脑缺血再灌注 GDNF

　　Protective function of estradiol after cerebral ischemia reperfusion and its effect on the expression of GDNF

　　LI Xin，WANG JianPing，LIU ChunLing，et al.

　　Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital, Zhengzhou University，Zhengzhou 450014, Henan, China

　　【Abstract】 Objective To study the protective function of estradiol after cerebral ischemia reperfusion and its effect on the expression of GDNF. Methods Rat cerebral ischemiareperfusion injury model was established with suture emboli method to observe infarction volumes and the score of neurological behavior and the expression of GDNF. Results Compared with pure ischemiareperfusion injured group, estradiol treatment group showed significant decrease of the score of neurological behavior，as well as cerebral infarction volumes was reduced significantly.In the injured cortex, the expression of GDNF were upregulated significantly at 24 h after reperfusion (P<0.05). Conclusions Estradiol has significantly cerebral protective effect and can induce upregulation of GDNF expression.

　　【Key words】 Estradiol;Cerebral ischemia reperfusion;GDNF

　　脑血管病(CVD)是神经系统的常见病及多发病，是目前人类三大死亡原因之一〔1〕，其中，缺血性脑血管病(ICVD)占到70%。最近有研究报道雌激素可以使脑缺血再灌注后内源性脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)表达上调而发挥脑保护作用〔2,3〕。而关于雌激素对胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)表达影响的研究甚少。本实验应用免疫组化方法观察雌二醇对GDNF表达的影响，以期进一步揭示雌激素的脑保护作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物与分组

　　健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由河南省实验动物中心提供。随机分为假手术组8只，手术对照组32只，雌二醇组32只。后两组又根据再灌注时间的不同分为6、12、24和48　h 4个小组，每组8只。雌二醇治疗组于术前7 d每日腹腔注射17β雌二醇(0.1 ml/100 g)共7 d;假手术组和手术对照组每日均给予等量的花生油(溶解雌二醇的溶剂)腹腔注射。另取20只大鼠分为假手术组4只，手术对照组8只，雌二醇组8只。在脑缺血2 h再灌注24 h后断头取脑测量梗死体积。

　　1.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型〔大脑中动脉阻断法(MCAO)〕制作

　　参照Longa制作脑缺血再灌注模型。手术对照组和雌二醇组于手术后2 h麻醉下将尼龙线拔出，假手术组除不插尼龙线外其余步骤同上。模型大鼠神经功能评分参考Bederson的5分制评分标准：0分：无神经损伤症状;1分：不能完全伸展右侧前爪;2分：向右侧转圈;3分：向右侧倾倒;4分：不能自发行走，丧失意识，包括术后24 h内死亡。除掉0分和4分方可入组。

　　1.3 GDNF检测

　　于缺血2 h再灌注6、12、24和48 h后将大鼠断头处死，迅速取脑，于视交叉前后各1 mm将脑冠状切开，将厚2 mm脑片置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水，石蜡包埋。常规切片，片厚4 μm，用SP法进行免疫组化染色。SP免疫组化试剂盒、GDNF多克隆抗体均购于北京中山生物试剂有限公司。切片置60℃恒温烤箱中烘烤30 min。石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗3次，每次5 min，微波抗原修复，血清封闭。滴加GDNF一抗(1∶100)，置4℃冰箱过夜。加生物素标记的二抗(1∶200)，室温下孵育40 min。加辣根酶标记链酶卵白素(1∶200)，室温下孵育40 min。以上每步均PBS液冲洗3次，每次5 min。DAB显色，显微镜下控制反应时间。常规封片。结果判定：细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。每时间点每张切片，在400倍光镜下随机查200个神经元，计数阳性细胞个数。

　　1.4 脑梗死体积测定〔4〕

　　缺血2 h再灌注24 h后断头取前脑，从前向后作厚1 mm的切片，置于2%TTC溶液中避光温浴30 min，之后用10%甲醛溶液固定，10 d内测定梗死体积。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，多组均数间比较采用单因素方差分析与q检验，两样本均数比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后神经功能影响

　　雌二醇组神经功能评分显著降低，见表1。表1 大鼠脑缺血2 h再灌注后大鼠神经功能评分(略)

　　2.2 雌二醇对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积影响

　　TTC染色显示假手术组脑片染成均匀红色，无梗死灶。手术对照组和雌二醇组均出现染成苍白色的梗死灶，位置恒定于大脑中动脉供血的额、顶叶皮质及基底节区。手术对照组梗死体积(83.42±4.30)mm3，梗死体积百分比为(23.31±1.41)%，明显高于雌二醇组梗死体积(60.96±5.15)mm3和梗死体积百分比(16.96±1.37)%(P<0.01)。

　　2.3 GDNF在皮层表达变化及雌二醇的影响

　　缺血再灌注6 h时假手术组GDNF阳性细胞数为(29.75±6.20)个/200个神经元，其后12、24、48 h未进行检测。缺血再灌注6 h时手术对照组和雌二醇组GDNF阳性细胞数与假手术组无明显差异，其后随时间的增加，阳性细胞数逐渐增加(P<0.01)，在缺血再灌注24和48 h时雌二醇组阳性细胞数则高于手术对照组(P<0.01)，见表2。表2 各组皮层GDNF阳性细胞数(略)

　　3 讨 论

　　本实验通过病理学观察发现雌二醇组脑梗死体积显著缩小，与文献报道一致〔5,6〕。我们还观察到，手术对照组实验大鼠神经功能评分明显高于雌二醇组，这些证实了局灶性脑缺血再灌注时应用雌二醇可明显减轻脑组织的不可逆损害，从动物实验表明雌二醇具有确切的脑保护作用。

　　GDNF及其受体GDNFRα和Ret在脑缺血后表达均增加。Miyazaki报道短暂前脑缺血后，海马RetmRNA表达升高，12 h达高峰，并受GDNF调控〔7〕。Sarabi报道MCAO 90 min再灌注0，6，12和24 h组，在CA3、齿状回、皮质和纹状体GDNFRα mRNA表达增多，在齿状回6 h达高峰;在CA3区GDNFα mRNA在24 h再灌注期间逐步上调;在皮质，GDNFRα mRNA表达高峰在0和24 h;在纹状体，GDNFRα mRNA和cret mRNA再灌注伊始即上调，可见GDNF受体上调在时间和区域上有差异，可能受GDNF调控，相应GDNF的神经保护作用在不同脑区也不同〔8〕。MCAO30 min再灌1 h 可诱导GDNF mRNA和蛋白在梗死灶周围皮质和纹状体表达，3 h 达高峰，24 h明显减少。免疫组化染色，皮质和尾核神经元有GDNF着色且皮质强度大于尾核，还发现再灌注72 h后GDNF mRNA和蛋白质表达出现二次高峰，双染表明GDNF早期峰在神经元，第二次增高定位在胶质细胞〔9〕。

　　本实验观察到脑缺血再灌注损伤后GDNF在皮层表达的变化，缺血2 h再灌注6 h后，假手术组与手术对照组表达无差别;再灌注24 h后，手术对照组表达达高峰，与假手术组差异显著;再灌注48 h后，手术对照组GDNF表达已下降，但与假手术组相比仍有显著差异;本实验中GDNF表达时程与文献中不完全一致，可能是因缺血时间长短不同和大鼠种类不同所致。

　　脑缺血后内源性GDNF表达增加对保护神经细胞有重要意义，在应用雌二醇后皮层GDNF表达上调，而且是在再灌注12 h后开始表达上调，GDNF皮层表达在再灌注24 h时达高峰，这提示雌二醇能能够在脑缺血再灌注晚期对神经元起保护作用。值得注意的是，再灌注12 h后，NGF和BDNF表达已下降〔2,3〕。雌二醇有可能通过上调GDNF的表达，从而发挥脑保护作用。

　　【参考文献】

　　1 王新德, 史玉泉, 陈汉白. 脑血管疾病〔M〕. 北京:中国科学技术出版社,1993:13.

　　2 卢 宏, 宋志宇，王建平，等. 外源性雌二醇对脑缺血再灌注损伤大鼠脑源性神经营养因子和神经生长因子表达的影响〔J〕.中国临床康复，2005; 25 (9):968.

　　3 卢 宏，王建平，李 昕,等. 雌二醇对大鼠脑缺血/再灌注损伤脑组织BDNF表达的影响〔J〕.郑州大学学报(医学版)， 2005;40(1):479.

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　　5 Koh PO.Estradiol prevents the injuryinduced decrease of 90 ribosomal S6 kinase (p90RSK) and Bad phosphorylation〔J〕. Neurosci Lett，2007;412(1):6872.

　　6 Farr TD,Carswell HV,Gallagherl，et al. 17 betaestradiol treatment following permanent focal ischemia does not influence recovery of sensorimotor function〔J〕. Neurobiol Dis，2006;23(3):55262.

　　7 Miyazaki H, Nagashima K, Okuma Y, et al.Expression of Ret receptor kinase after transient forebrain ischemia is modulated by glial cell linederived neurotrophic factor in rat hippocampus〔J〕. Neurosci Lett, 2002;318(1):14.

　　8 Sarabi A, Chang CF, Wang Y, et al. Time course study of GFRα1 expression in an animal model of stroke〔J〕. Exp Neurol, 2001;170(2): 2839.

　　9 Wei G, Wu G, Cao X. Dynamic expression of glial cell linederived neurotrophic factor after cerebral ischemia〔J〕. Neuro Report, 2000;11(6):117783.