HLADRB1基因多态性与慢性肾小球肾炎相关性

　　作者：王珏　　作者单位：山东大学

　　【摘要】探讨慢性肾小球肾炎(CGN)与人类白细胞抗原(HLA)DRB1等位基因的相关性。方法 以山东省3大省级医院近十年汉族CGN尿毒症患者1?073例为病例组，选择中国造血干细胞捐献者资料库山东分库汉族人7?418名汉族健康志愿捐献者为对照组，对两组的HLAⅡ类DRB1基因多态性进行分析比较，探讨HLADRB1基因多态性与CGN的关系;并随访了部分携有易感基因的患者，评价其预后。结果 病例组中HLADRB1*18基因频率高于对照组(P<0.001)，可能是CGN尿毒症的易感基因，且随访发现携有该类基因的患者预后较差。病例组中HLADRB1*16基因频率低于对照组(P<0.001)，可能是CGN尿毒症的保护基因。结论 山东汉族人群CGN与HLADRB1关联，且携有可能易感基因的患者预后较差。

　　【关键词】 慢性肾小球肾炎 尿毒症 HLA抗原 基因频率 易感基因

　　the human leukocyte antigen DRB1

　　WANG Jue1, LIU Junli2, ZHAO Jingjie2

　　(1. Marine College of Shandong University at Weihai, Weihai 264209， Shandong， China;

　　2. Lab of Clinical Molecular Biology, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033， China)

　　To explore the association between chronic glomerulonephritis(CGN) and the human leukocyte antigen(HLA)DRB1 on DNA levels and to find susceptibility genes and protective genes, so as to further explain the possible pathogenesis of CGN. Methods 1?073 Han renal transplantation patients were included in this study. All patients were recruited from three provincial Hospitals during the past ten years. The control group contained 7?418 healthy Han volunteer donors from the Shandong Hematopoietic Stem Cell Data Bank of China. We collected data about the polymorphism of HLADRB1. Gene frequency (GF), relative risk (RR) and correlation test were analyzed by using statistical software. Some patients carrying the susceptibility genes were followed up 1, 3 and 5 years, and their survival rates were compared. Results The frequency of the HLADRB1*18 allele increased more significantly in the CGN patients than in controls. They might be the suspicious susceptibility genes of CGN. After the followup, the prognosis of patients with the susceptibility genes was worse than that of the controls. However, the frequency of the HLA DRB1*16 alleles decreased more significantly in the CGN patients than that in the controls. They might be the protective genes of CGN. Conclusion There might be corresponding susceptibility and protective genes of CGN in the Shandong Han population, and interestingly, the prognosis of patients with the susceptibility genes is worse than that of the controls.

　　Key words： Chronic glomerulonephritis; Uremia; HLA antigens; Gene frequency; Susceptibility genes

　　人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)即人类主要组织相容性复合体(MHC)，是位于第6号染色体短臂上的一个紧密连锁的基因群，相应DNA片段长度是3?600?kb。它是人类最复杂的显性多态性遗传系统，具有明显的种族、地域差异，与移植密切相关，是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统[1]。研究表明，糖尿病肾病、高血压肾病是国外慢性肾功能衰竭尿毒症患者的主要病因[2]，而在我国，主要病因则为慢性肾小球肾炎(CGN)[3]。有关HLA基因型与CGN关联性研究国内外均有报道，但对于具有种族、地域性差异的群体性疾病而言，这些研究普遍存在样本量相对较小，结果也各有差异。山东省是人口大省，CGN患者近万人，迄今还无此类研究。本研究通过利用临床提供的HLA基础性资料，在DNA水平上探讨HLA与CGN尿毒症的相关性，旨在为该病的辅助诊断、预测、分类、预后判断及制定防治措施等提供依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 病例组：1996年1月至2005年1月，山东大学第二医院、齐鲁医院、济南军区总医院移植中心(占全省肾移植量90%)肾移植患者中，经病历相关记录及病理穿刺活检报告确认均为山东籍汉族CGN尿毒症患者共1?073例，其中男652例，女421例，18～75岁，平均(40.4±13.7)岁。对照组：选择中国造血干细胞捐献者资料库山东分库的志愿者、山东籍健康的无血缘关系的个体共7?418名，其中男4?401名，女3?017名，21～60岁，平均(35.9±10.9)岁。

　　1.2 调查方法 通过病历获取患者的一般特征、HLA基因型等指标;通过查阅中国造血干细胞捐献者资料库山东分库资料获得对照组有关信息;并于2006年9～12月，对携带易感基因及未携带易感基因的部分患者术后生存情况进行了电话随访，病例回访率为92.3%(363/393)。

　　1.3 标本采集 均取清晨空腹肘静脉血液4?mL，EDTANa2抗凝，充分混匀。

　　1.4 DNA提取 采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)试剂盒，严格按试剂盒说明操作。测260?nm(A260)的OD值确定DNA浓度，双链DNA浓度约50?μg/mL左右，纯度(A260/A280)约1.8。

　　1.5 HLADRB1 PCRSSP配型操作步骤 采用德国BIOTEST公司HLADRB1分型试剂盒，取1块96孔板，检测4个DNA样本的HLADRB1，每孔反应体系10?μL，包括：440?μL PCR cocktail、7?μL Taq聚合酶及550?μL蒸馏水。将微孔板放入ABI9700PCR仪进行扩增，反应条件按试剂盒说明书进行。

　　1.6 电泳分析 取10?μL扩增产物依次加入2%的琼脂糖凝胶96孔中，将凝胶放入紫外线透射反应仪器下观测结果，在相应泳道中检出清晰的DNA片断为特异性条带，并在成相仪中扫描成像。将观察到的特异性条带对应的号码输入计算机，利用试剂盒配套的分析软件，即可获得HLADRB1的基因分型结果。

　　1.7 统计学处理 选择HLA的特异性计数作为计算指标，应用FISHER软件计算基因频率(GF)、单倍型频率(HF)、相对危险度(RR)及显著性检验(χ2)，并应用乘积-极限法(PL法)与logrank检验进行生存分析。

　　2 结 果

　　2.1 HLADRB1电泳图像 见图1。病例组871～874电泳图，右上角第一孔为污染监控孔，每排内对照条带前检出的清晰DNA片断为特异性条带，将特异性条带对应的号码输入计算机，利用试剂盒配套的分析软件，得病例组4位患者HLADRB1分型结果，分别为：DRB1*04、DRB1*07，DRB1*11、 DRB1*17，DRB1*13、DRB1*15，DRB1*09、DRB1*15(其他患者及对照组图像均相似，只是特异性条带位置不同而决定了不同的HLA分型结果)。

　　2.2 HLADRB1位点基因频率 对照组中共检出DRB1基因13种，基因频率高低依次是：DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04等;病例组检出DRB1等位基因14种，基因频率高低依次是：DRB1*07、DRB1*04、DRB1*15、DRB1*09、DRB1*12等(表1)。其中HLADRB1*18基因频率高于对照组(RR=174.72，P<0.000?1);病例组中HLADRB1*16基因频率低于对照组(RR=0.47，P<0.001)。对照组(n=7?418)特异性计数抗原频率基因频率病例组(n=1?073)特异性计数抗原频率基因频率χ2值P值RR0.057?40.029?10.070?80.036?11.26DRB1*041?4130.190?50.100?32760.257?20.138?226.20<0.000?11.47DRB1*071?9970.269?20.145?12770.258?20.138?70.580.95DRB1*080.115?70.059?60.082?90.042?410.13<0.0010.69DRB1*091?6840.227?00.120?82340.218?10.115?70.430.95DRB1*100.028?80.014?50.041?90.021?25.43<0.0251.49DRB1*110.109?30.056?21640.152?80.079?617.46<0.000?11.47DRB1*121?4480.195?20.102?92080.193?80.102?10.010.99DRB1*131?0740.144?80.075?21300.120?20.062?04.65<0.050.81DRB1*140.108?90.056?01240.115?60.059?60.421.07DRB1*152?3840.321?40.176?22760.256?30.137?618.46<0.000?10.73DRB1*160.043?30.021?90.020?50.010?312.54<0.0010.47DRB1*170.076?20.038?80.053?10.026?97.33<0.010.69DRB1*18 0.000?00.000?00.011?20.005?683.08<0.000?1174.72

　　2.3 携有易感基因CGN者术后移植肾的生存率分析 随机抽取213例携带易感基因和180例未携带易感基因的肾移植患者进行电话随访，得到有效病例分别为196例和167例，应答率为92.3%。用PL法计算移植肾1、3、5年生存率，携带组分别为96.1%、70.5%、52.3%，未携带组分别为99.2%、90.7%、75.4%。两组生存率曲线经logrank检验，χ2=6.6783，P<0.01，表明携带不同基因的患者移植肾的生存率不同，见图2。

　　Survival rate of patients carrying susceptibility genes

　　3 讨 论

　　3.1 山东人群HLADRB1分布 本研究所采用的正常对照为中国造血干细胞捐献者资料库山东分库的7?418名志愿者，在正常对照组中共检出DRB1基因13种。HLADRB1基因频率高低依次是：DRB1*15、DRB1*07、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*04等。与山东脐血库HLA DRB1基因频率资料分布相接近[45], 但与江浙沪等南方地区汉族频率有差异[6]。由此可见，本研究所采用的正常对照的HLADRB1基因基本具有中国北方汉族共有的遗传特征，能代表山东地区人群HLADRB1的分布特征。

　　3.2 CGN的易感基因与保护基因 CGN病因机制尚未明确，肾小球基底膜免疫复合物形成是否受到HLA基因一般性的作用，20世纪90年代以来引起人们的重视。Vaughan等[7]检测了52例英国患者和29例希腊患者发现HLADQB1*05 显著升高;在英国患者中还有HLADRB1* 17 显著升高( 80%　vs　27%)。Papasteriades等[8]的研究显示，希腊患者HLADRB1*03显著减少，认为HLA 基因产物可以影响CGN的临床表现和预后。Fisher等[9]认为，由自身抗体引起的CGN与HLADRB1*05关联，与HLADRB1*03和HLADRB1*07有潜在关联。国内研究中，肖露露等[10]报道219例广东地区CGN与HLADRB1*10、DQB1*07有显著意义。

　　本研究资料中病例组共检出HLADRB1基因14种。其中HLADRB1*18基因频率高于对照组(0.005?6　vs　0.000?0，RR=174.72，χ2=83.08)。HLA抗原中DRB1*18基因可能是山东汉族人群CGN的易感基因。HLADRB1*16基因频率低于对照组(0.010?3　vs　0.021?9，RR=0.47，χ2=12.54)，HLA抗原中DRB1*16基因可能是山东汉族人群CGN的保护基因。提示，山东汉族人群CGN与HLA具有强关联性，HLADRB1*18和DRB1*16可能是山东汉族人群是否易感CGN的免疫遗传学基础。

　　研究表明，成人CGN与HLA系统免疫机制强相关，HLA系统某些基因可能是中国人群易感CGN的风险因子[1011]。本研究结果与其结论有所不同,一方面可能因为高度多态性分布的HLA系统具有明显的种族性和地域性差异;另一方面可能与研究的人群及样本量大小不同有关。

　　3.3 携有易感基因患者移植肾的生存分析 本研究通过随访部分携有易感基因患者，发现移植肾1、3、5年成活率分别为：96.1%、70.5%、52.3%，与未携带组(99.2%、90.7%、75.4%)及有关报道(98.7%、87.4%、70.1%)1年、3年、5年成活率[12]相比显著减少，且具有统计学意义(P<0.01)。提示携带易感基因的CGN患者其预后可能较差。

　　综上所述，本课题首次通过大样本研究发现影响山东汉族人群CGN的易感基因和保护基因，并推论携有易感基因的肾移植患者可能预后较差。研究结果对CGN的临床治疗、预后及预防措施提供了理论依据。

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