盐酸多奈哌齐对血管性痴呆小鼠海马ERK2及p-ERK表达变化的影响

　　作者：王雪笠 胡亚卓 吕佩源 肖向建 董艳红 翟金萍 何春年 作者单位：河北医科大学神经内科教研室，河北 石家庄 050017

　　【摘要】 目的 探讨盐酸多奈哌齐对血管性痴呆(VD)小鼠海马中细胞外信号调节激酶(ERK2、p-ERK)表达变化的影响。方法 采用双侧颈总动脉反复缺血-再灌注法制备小鼠VD模型。将小鼠随机分为对照组、模型组及药物组，药物组给予盐酸多奈哌齐灌胃治疗。术后第29、30天，经跳台试验和水迷宫试验对各组小鼠进行行为学成绩测试，用免疫组化方法观察各组小鼠海马CA1区ERK2及海马CA3区p-ERK的表达变化。结果 盐酸多奈哌齐明显改善了VD小鼠学习、记忆成绩(P<0.05)。模型组海马CA1区ERK2的阳性细胞数目较对照组,药物组减少(P< 0.05)，阳性细胞平均光密度值亦较对照组、药物组降低(P< 0.05);CA3区p-ERK阳性部位平均光密度值较对照组、药物组降低(P< 0.05)。而药物组与对照组间上述变化无显著性差异(P> 0.05)。结论 ERK2的表达减少可能参与了VD的发病机制，盐酸多奈哌齐通过增加乙酰胆碱含量，后者作用于毒蕈碱乙酰胆碱受体(M受体)激活ERK(p-ERK)，有助于改善学习和记忆功能。

　　【关键词】 血管性痴呆;小鼠;细胞外信号调节激酶;免疫组化;海马

　　The effect of donepezil hydrochloride on the changes of ERK2 and p-ERK in hippocampus of mice with vascular dementia

　　WANG Xue-Li,HU Ya-Zhuo, Lü Pei-Yuan, et al.

　　Department of Neurology, Hebei Provincial People’s Hospital, Shijiazhuang 050051, Heibei, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of donepezil hydrochloride on the changes of extracellular signal-regulated kinase (ERK2 and p-ERK) in hippocampus of mice with vascular dementia (VD).Methods Kunming mice were divided into sham, model and treatment group with donepezil hydrochloride randomly. The models of VD mice were established through three times ischemia-reperfusion of bilateral common carotid arteries. The behavioral scores of three groups were investigated by step-down test and water maze test at days 29, 30 respectively. The expressing changes of ERK2 in hippocampus CA1 and p-ERK in hippocampus CA3 were observed by immunohistochemistry technique. Results The grades of learning and memory of VD mice were obviously improved by donepezil hydrochloride (P<0.05). The number of positive ERK1 neurons 〔(16.17±0.75) vs (23.17±1.08) , P<0.05〕 was less, the average optical of positive neurons was also lower 〔(0.208 3±0.004 8) vs (0.240 0±0.005 8) , P<0.05〕 in hippocampus CA1 of model group than that in sham group. The average optical of positive p-ERK in hippocampus CA3 was lower than that in sham group 〔(0.186 7±0.008 4) vs (0.271 7±0.012 2) ; P<0.05〕. However, there was no significant difference between sham and treatment group (P>0.05). Conclusions The decreased expression of ERK2 and p-ERK in hippocampal neurons may participate in the pathogenesis of VD. Donepezil hydrochloride could increase the content of acetylcholine which could activate ERK through M receptor and furthermore improve abilities of learning and memory.

　　【Key words】 Vascular dementia; Mice; Extracellular signal-regulated kinase; Immunohistochemistry; Hippocampus

　　血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是因脑血管疾病所致的智能及认知功能障碍临床综合征，目前，其发病机制仍不十分清楚。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中的重要成员，最初被认为和细胞的生长、发育、分化有关，最近研究表明，ERK信号通路与学习记忆有密切关系〔1〕。众所周知，VD的重要表现之一是学习和记忆障碍，海马是学习、记忆的重要结构。因此，本研究观察了VD小鼠海马组织中ERK2及p-ERK的表达变化，以期进一步探讨VD的发病机制，并同时观察了第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂盐酸多奈哌齐对其表达变化的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 3月龄雄性昆明小鼠(购自河北省实验动物中心)90只，合格证编号：DK0509119，体重(32.5±2.5)g。ERK2及p-ERK免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);安理申(盐酸多奈哌齐，卫材制药有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备 将小鼠随机分为对照(假手术)组、模型组和药物(盐酸多奈哌齐治疗)组，每组30只。采用双侧颈总动脉反复缺血-再灌注加尾端放血的方法〔2，3〕制备VD模型作为模型组。假手术组作为对照组，此组仅暴露双侧颈总动脉而不结扎，且尾部不放血。药物治疗组先制备VD模型，术后第2天经胃管给予盐酸多奈哌齐3 mg·kg-1·d-1，每天1次，共30 d;对照组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

　　1.2.2 行为学成绩测试 术后第29、30天，分别对各组存活小鼠行跳台试验和水迷宫试验测试学习和记忆成绩。

　　1.2.3 标本制备 术后第30天，每组取6只小鼠，以4%多聚甲醛经心脏灌注取脑，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。将包埋好的脑组织连续切片，厚度5 μm，供免疫组化观察，方法按试剂盒说明书进行。

　　1.2.4 标本观察 参照文献〔4，5〕，运用Image-Pro Plus图像分析软件分别计算各组海马CA1区相同面积内ERK2阳性细胞数，并对阳性细胞进行平均光密度测定，对海马CA3区p-ERK的阳性部位进行平均光密度测定。

　　1.2.5 统计方法 数据x±s表示，运用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD-t检验进行3组间的两两比较。

　　2 结果

　　2.1 跳台试验和水迷宫试验 表1及表2显示模型组的学习和记忆成绩均低于对照组(P< 0.05)，而药物组高于模型组(P<0.05)，药物组与对照组比较无显著差异。

　　2.2 海马CA1区ERK2免疫组化阳性神经元观察 对照组海马CA1区层次清楚，有大量的ERK2 免疫反应阳性神经元，排列紧密，呈棕黄色，胞体较大，圆形或椭圆形，有的可见突起。而模型组阳性神经元数目明显减少，胞体变小，核固缩，排列松散。药物组可见阳性神经元数目较模型组增多，排列较紧密，胞体变大。见图1。

　　表1 小鼠跳台试验的学习和记忆成绩(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05，下表同

　　表2 小鼠水迷宫试验的学习和记忆成绩(略)

　　图1 各组小鼠海马CA1区ERK2及CA3区p-ERK的表达(免疫组化，×200)(略)

　　2.3 海马CA3区p-ERK阳性部位观察 p-ERK阳性部位主要位于CA3区辐射层(树突)，对照组免疫反应阳性产物呈棕褐色，染色较深，树突稠密，侧支丰富。而模型组免疫反应阳性产物染色较淡，树突稀疏，侧支较少。见图1。药物组较模型组明显好转。经图像分析发现，模型组分别与对照组、药物组相比，p-ERK阳性部位平均光密度值明显降低(P<0.05)，而药物组与对照组间无明显差别(P>0.05)，见表3。

　　2.4 各组小鼠海马CA1区ERK2及CA3区p-ERK阳性细胞数及平均光密度值比较 模型组与对照组相比，CA1区ERK2免疫反应阳性神经元数及阳性细胞平均光密度值明显降低(P<0.05)，药物组与模型组相比明显升高(P<0.05)，而药物组与对照组间无明显差别(P>0.05)。CA3区p-ERK阳性部位平均光密度值模型比对照组明显降低(P<0.05)，药物组比模型组明显升高(P<0.05)，药物组与对照组间无明显差别(P>0.05)。见表3。

　　表3 各组小鼠海马ERK2、p-ERK阳性细胞数及阳性细胞平均光密度的比较(略)

　　3 讨论

　　学习和记忆是脑的高级功能，VD所致的学习、记忆功能障碍也是一个极其复杂的病理生理过程。ERK包括ERK1和ERK2，又称p44MAPK和p42MAPK，是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，p-ERK是其活性形式。ERK的底物包括细胞内其他重要的激酶、转录因子、组蛋白以及K+通道等，这些物质是细胞内的重要组成成分，是学习记忆形成过程中必不可少的。并且ERK可能参与了神经元形态学可塑性的形成过程。

　　在本试验中，我们发现ERK2在VD小鼠海马CA1区表达下降，究其原因可能是，①神经细胞缺血缺氧，发生凋亡或坏死。②ERK三级级联反应中的Raf-1、MEK、ERK是NMDA受体复合体的主要组成成分〔6〕，已有研究表明，NMDA受体在VD小鼠中表达减少〔7〕。③ERK表达减少，神经细胞失去ERK所发挥的保护性作用，自我修复能力差，病变更加严重。④蛋白含量增减与许多因素有关,如转录、翻译或合成降解等水平的变化，有待于进一步研究。对于ERK的活性形式p-ERK发现其免疫反应阳性物质主要分布在海马CA3区。由于海马CA1区对缺血缺氧非常敏感，大部分对学习记忆的研究都集中于CA1区，而海马CA3区亦与学习记忆有密切关系。已有研究表明，海马CA3区与联想式记忆密切相关〔8〕，并与空间辨别性学习记忆有关〔9〕。海马CA3区突触后膜致密物质厚度与记忆保持的程度密切相关〔10〕。选择性破坏小鼠海马CA3 区神经元及苔状纤维集群，结果引起小鼠的记忆保持量迅速下降，半衰期显著缩短〔11〕。进行一次性被动回避反应学习的小鼠，在学习前后不同时期观察其海马CA3区，发现海马CA3区突触结构有可塑性变化〔12〕。p-ERK可以使海马细胞的树突发生形态学改变，在树突柄和树突棘上伸出新的丝足，可能参与了神经元形态学可塑性的形成过程，有助于信息的传递和接受〔13〕。因而我们推测，VD小鼠学习记忆能力下降与海马CA3区ERK活性形式p-ERK表达下降有关。

　　盐酸多奈哌齐是可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，通过可逆性抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的降解,增加乙酰胆碱含量，后者作用于毒蕈碱乙酰胆碱受体(M受体)可以激活ERK的表达，有助于调整学习和记忆〔14〕。此外，盐酸多奈哌齐的增加脑血流量、减轻淀粉样蛋白的神经毒性及减轻自由基损伤导致的神经变性等作用〔15〕可能也有助于VD小鼠的治疗。

　　综上所述，VD小鼠海马CA1区ERK2，CA3区p-ERK表达下降，与小鼠的学习、记忆功能受损有关。盐酸多奈哌齐通过促进VD小鼠海马CA1区ERK2，CA3区p-ERK的表达，从而改善VD小鼠的学习记忆成绩。

　　【参考文献】

　　1 胡亚卓,吕佩源.MAPK/ERK信号转导通路与学习记忆〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志,2006;13(6):369-72.

　　2 李 巍,张世仪,赵惠敏,等.小鼠脑缺血性学习记忆障碍模型的建立〔J〕.基础医学与临床,1995;15(6):46-9.

　　3 赵建新,田元祥,李国明,等.脑缺血再灌注拟血管性痴呆小鼠皮层及海马细胞病理形态学动态观察〔J〕.中风与神经疾病杂志,2000;17(4):200-2.

　　4 秦照萍,叶树明,杜继曾,等.传入神经阻滞对成年大鼠嗅球calbindin表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2006;22(3):605-11.

　　5 于 欣,张建中,马爱玲,等.大鼠正常血糖脑缺血及高血糖脑缺血时p38MAPK的表达〔J〕.宁夏医学院学报,2006;28(4):283-5.

　　6 Husi H，Ward MA，Choudhary JS，et al.Proteomic analysis of NMDA receptor-adhesion protein signaling complexes〔J〕.Nat Neurosci,2000;3(7):661-9.

　　7 吕佩源,宋春风,樊敬峰,等.石杉碱甲对血管性痴呆小鼠海马NMDA受体及mRNA表达的影响〔J〕.中国医院药学杂志,2005;25(9):800-2.

　　8 Nakazawa K,Quirk MC,Chitwood RA,et al.Requirement for hippocampal CA3 NMDA receptors in associative memory recall〔J〕.Science,2002;297(5579):211-8.

　　9 宿宝贵,潘三强,韩 辉,等.学习记忆的形态学基础的研究〔J〕.解剖学研究,2003;25(2):142-3.

　　10 章子贵,陆汉新,李振武,等.小鼠记忆保持能力与海马CA3区突触界面结构的相关性〔J〕.中国神经科学杂志,1995;2(3):136-40.

　　11 陈惟昌,于 萍,李占魁,等.破坏海马CA3区后小鼠记忆动力学变化〔J〕.中日友好医院学报,1996;10(2):95-7.

　　12 肖 鹏,何胜昔,许世彤,等.海马CA3区突触结构在记忆中的变化〔J〕.中国行为医学科学,2005;14(1):26-8.

　　13 Wu GY，Deisseroth K，Tsien RW.Spaced stimuli stabilize MAPK pathway activation and its effects on dendritic morphology〔J〕.Nat Neurosci,2001;4(2):151-8.

　　14 Berkeley JL，Gomeza J，Wess J,et al.M1 muscarinic acetylcholine receptors activate extracellular signal-regulated kinase in CA1 pyramidal neurons in mouse hippocampal slices〔J〕.Mol Cell Neurosci,2001;18(5):512-24.

　　15 吴 畏,张 艺,葛 勤,等.第二代胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐的药理作用及临床应用〔J〕.中国药房,2003;14(5):310-2.