趋化因子FKN对单个核细胞MMP2表达的影响及PKC在其中的作用

　　作者：孙健 雷明明 杨春艳 吴哲 李淑萍 王红 作者单位：吉林大学第二医院心血管内科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨趋化因子Fractalkine(FKN)对单个核细胞基质金属蛋白酶(MMP)2表达的影响及蛋白激酶C(PKC)在其中的作用。方法 采用聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞。将提取的单个核细胞分为：空白对照组、FKN组及Ro318220(PKC阻断剂)组。应用明胶酶谱法检测各组单个核细胞中MMP2表达情况。结果 MMP2在FKN组〔(619±34.77)INT·mm2〕较空白组〔(3 285±54.69)INT·mm2〕表达明显减少(P<0.05)，在Ro318220组〔(2 478.33±64.31)INT·mm2〕较FKN组表达明显增多(P<0.05)。结论 趋化因子FKN可以抑制单个核细胞MMP2的表达，这一作用可能是通过PKC途径实现的。

　　【关键词】 动脉粥样硬化;FKN;PKC;MMP2

　　基金项目：吉林省科技发展计划项目资助课题(200705235)

　　研究发现，炎症内皮细胞释放的趋化因子(fractalkine，FKN)与NK细胞、单核细胞、淋巴细胞上的受体CX3CR1结合以后，可以增强自然杀伤细胞(NK)的杀伤力，导致血管内皮细胞损伤〔1〕，同时使单核细胞、淋巴细胞向血管内皮细胞趋化、黏附，从而促进动脉粥样硬化的形成。基质金属蛋白酶(MMP)s是一组含锌的蛋白水解酶，能特异性地降解细胞外基质和胶原纤维，使动脉粥样硬化斑块破裂，尤以MMP2作用更为强烈。MMP2能特异性降解纤维帽中的胶原Ⅳ，使斑块破裂，导致急性心肌梗死〔2〕。目前国内尚未见FKN与MMP2关系的研究报道，Vitale〔3〕研究发现FKN可以抑制单核细胞MMP2的表达，但对其机制未进一步研究。本研究观察FKN对人单个核细胞MMP2表达的影响，并探讨PKC在其中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 人外周血浓缩白细胞、低糖DMEM(LGDMEM，Gibco)，优等胎牛血清(FBS，Hyclone)，Ficoll分离液(浓度1.077 g/ml)(Pharmacia)，胰酶、EDTA(Promega)，重组人FKN(PeproTech Inc)，Ro318220(Sigma)，gelatin(BioRAD)，丙烯酰胺、N,N′亚甲基双丙烯酰胺、Tris碱、二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺(Promeg)，TrisGlycine SDS sample(Ameresco 公司)。

　　1.2 人外周血单个核细胞的分离 无菌条件下，采用聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法从人外周血浓缩白细胞中分离人外周血单个核细胞。

　　1.3 实验分组 用含10%FBS的RPMI1640培养液调整人外周血单个核细胞浓度至5×106个单个核细胞/ml，接种于96孔板中，每孔200 μl，实验分为3组，每组2个复孔：①空白对照组：单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照，37℃，5%CO2培养箱中孵育2h后，加入FKN溶媒对照，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。②FKN组：在单个核细胞中加入抑制剂溶媒对照,37℃，5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入FKN(终浓度为0.5 μg/ml)，37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。③Ro318220组：在单个核细胞中加入Ro318220(终浓度为50 μmol/L)，37℃，5%CO2培养箱中孵育2 h后，加入FKN(终浓度为0.5 μg/ml)，37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。

　　1.4 MMP2含量的检测 分别收集各组单个核细胞培养液上清，将各组上清以1 800 r/min离心1 min后，在37℃水浴10 min。将事先配置好的10%聚丙烯酰胺(polyacrylamide)胶(含有1 g/L明胶)固定于电泳装置上后，电泳仪上、下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液(25 mmol/L Tris、250 mmol/L甘氨酸、0.1%SDS)，排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡，之后在每个加样槽中分别加入3 μl待检测样品与6 μl TrisGlycine SDS sample，将电泳装置与电源相接，80～120 V电压电泳1 h。从电泳装置上卸下玻璃板，小心取下胶。Renaturing Buffer脱色2次，每次20 min，之后更换为Developing Buffer过夜，倒出缓冲液，将凝胶浸泡于固定液(甲醇30 ml，冰乙酸10 ml，蒸馏水60 ml)中2 h后，将凝胶置于SafeStain中染色4 h，拍照记录。将电泳凝胶放在JS380A自动凝胶图像分析仪中照相处理，根据目的带的亮度和面积，NIH image 1.57 software程序自动读取并记录每条带密度的相对定量值，单位用INT·mm2表示。

　　1.5 统计学处理 数据以x±s表示，采用Bartlett法证明各组方差齐性后，采用方差分析和NewmanKeulsq检验进行组间两两比较。

　　2 结果

　　正常培养状态下单个核细胞培养液中MMP2的表达量相对较多，加入FKN诱导后单个核细胞培养液中MMP2表达量明显减少〔空白组(3 285±54.69)INT·mm2 vs FKN组(619±34.77)INT·mm2〕(P<0.05)。应用Ro318220阻断PKC后MMP2表达量〔Ro318220组(2 478±64.31)INT·mm2〕较FKN组明显增多 (P<0.05)(图1)。

　　1:Ro318220组;2 FKN组;3：空白组

　　图1 明胶酶谱法检测各组细胞培养液中MMP2浓度(略)

　　3 讨论

　　3.1 FKN抑制单个核细胞MMP2的表达 研究表明，动脉粥样硬化(AS)进展过程的不同阶段，损伤的内皮细胞、巨噬细胞源性泡沫细胞和其他细胞上以及动脉粥样硬化斑块中过度表达FKN和CX3CR1,与病情严重程度呈正相关，且FKN可以通过诱导单个核细胞表达NFκB和TNFα而促进AS的形成和进展〔4，5〕。MMPs是一组含锌的蛋白水解酶，能特异性地与细胞外基质成分相结合，降解细胞外基质，溶解胶原纤维，逐步使纤维帽变得愈加薄弱〔6〕，以MMP2作用更为重要。Brown 等对SAP和UAP病人的旋切斑块组织中明胶酶(MMP2，MMP9 )检测表明，MMPs活性增高是斑块不稳定的生化基础〔7〕。Kai对ACS患者血清MMP2和血浆MMP9水平进行测定，并与正常对照组进行对比，结果发现ACS患者血清MMP2和血浆MMP9水平高于正常对照组2～3倍,经药物治疗后，ACS患者血液中高水平MMP2和MMP9持续1 w后降至正常〔8〕。为探讨FKN是否可以通过上调单个核细胞中MMP2的表达而促进AS的形成，本研究将空白组与FKN刺激组的细胞培养液中的MMP2的浓度进行对比，结果显示，FKN刺激组的MMP2的浓度与空白组相比明显减少，表明FKN对单个核细胞MMP2的表达具有抑制作用。关于FKN与MMP2关系的研究，目前国内尚未见报道，Vitale〔3〕研究发现FKN可以抑制单核细胞MMP2的表达，这与本实验结果一致，但FKN是通过什么途径抑制单个核细胞MMP2表达尚未进一步研究。

　　3.2 PKC在FKN抑制单个核细胞MMP2表达中的作用 已有研究发现，PKC能调节MMPs的产生〔9，10〕，但在FKN影响MMP2表达中PKC是否也发挥作用，目前未见报道。本研究应用PKC特异性抑制剂Ro318220阻断PKC的作用，结果Ro318220+FKN组的MMP2浓度与FKN组相比明显增加，说明FKN可能通过活化PKC而抑制单个核细胞MMP2的表达;且阻断PKC途径，MMP2表达较FKN组明显增加，但与空白组相比仍然降低，说明FKN/CX3CR1系统还可能通过其他途径抑制单个核细胞MMP2的表达。有研究表明，IFNγ可以抑制MMP2的表达，而FKN可以促进IFNγ的表达，结合本研究我们推测：FKNCX3CR1可能通过活化PKC及促进IFNγ的产生等途径而抑制MMP2的表达。

　　FKN和MMP2都可以促进动脉粥样硬化的进展，但FKN如何对单个核细胞MMP2的产生具有抑制作用，目前未见相关报道，结合此前的研究，我们认为可能与FKN和MMP2在AS的不同时期所起的作用不同有关。FKN基本功能是趋化和黏附单个核细胞，进而使单个核细胞进入血管内皮下，吞噬脂质，转化为泡沫细胞，并分泌大量的免疫炎症因子，最终促进AS的形成和发展。上述过程发生的生物学事件主要发生在AS形成的早期阶段。现有的研究表明，MMP2似乎在AS晚期或者动脉粥样斑块的破裂中发挥着更为重要的作用，而动脉粥样斑块的破裂可以促使ACS的形成。因此，推测FKN可能在动脉粥样斑块形成的早期发挥更为重要的作用，此时MMP2表达较少，在动脉粥样斑块形成后，各种因素使MMP2表达增多，使斑块破裂，最终引发ACS的发生，但AS的形成和发展的不同时期或AS形成和进展的不同时间链中，FKN表达的量是否也不同，尚需进一步的实验证实。此外，动脉粥样硬化的形成是一个及其复杂的过程，其形成和发展更是受着诸多因素和环境的相互影响，虽然FKN抑制MMP2的表达，但同时MMP2还受到其他众多因素的影响，甚至这些因素可能对MMP2的表达具有更为重要的作用。

　　【参考文献】

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　　3 Vitale S,SchmidAlliana A,Breuil V,et al.Soluble fractalkine prevents monocyte chemoattractant protein1induced monocyte migration via inhibition of stressactivated protein kinase 2/p38 and matrix metalloproteinase activities〔J〕.J Immunol,2004;172(1):58592.

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　　5 孙 健，李淑梅，郑柳颖，等.FKN影响动脉粥样硬化的传导机制及G蛋白在其中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2007;27(6):5335.

　　6 Loftus M,Naybr AR,Goodall S.Increased matrix metalloproteinase9 activity in unstable carotid plaque:a potential role in acute plaque disruption〔J〕.Stroke,2000;31(1):407.

　　7 Brown DL，Hibbs MS,Kearney M,et al.Identification of 92kD gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions.Association of active enzyme synthesis with unstable angina〔J〕.Circulation,1995;91(8):212531.

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　　10 Alexander JP，Acott TS.Involvement of protein kinase C in TNFalpha regulation of trabecular matrix metalloproteinases and TIMPs〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001;42 (12)：2831.