纳络酮对大鼠脑出血周边组织谷氨酸、β内啡肽含量及细胞凋亡的影响

　　作者：侯丽淳 关雪莲 韩凤 赵锦程 作者单位：佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154003

　　【摘要】 目的 探讨纳络酮对大鼠脑出血周边组织谷氨酸(Glu)、β内啡肽(βEP)含量及细胞凋亡的影响。方法 Wistar 大鼠112只，随机分为脑出血组，脑出血+纳络酮干预组，两组各分为(出血前，出血后4、6、12、24、72 h、7 d)7个时间点。利用化学方法测定大鼠脑出血周边组织Glu含量，采用放免技术检测脑出血周边组织βEP含量;利用原位末端标记法测定出血周边组织中神经细胞的凋亡情况。结果 大鼠脑出血后4 h血肿周边脑区Glu含量开始升高(P<0.05;P<0.01)，在血肿形成的高峰期12 h达峰值;大鼠脑出血后4 h血肿周边脑区βEP含量开始升高(P<0.01)，在血肿形成的高峰期72 h达峰值。大鼠脑出血周边组织6 h出现凋亡细胞，12 h上升显著(P<0.01)，3 d凋亡细胞达峰值，7 d时仍存在较多凋亡细胞。纳络酮干预后，Glu 、βEP含量、凋亡细胞数量与脑出血组对应时间点比较显著下降(P<0.05;P<0.01)。 结论 大鼠脑出血周边组织Glu 、βEP含量增高，脑出血周边组织神经细胞存在长时间凋亡，Glu 、βEP可以促进其凋亡;纳络酮干预后Glu 、βEP含量降低，纳络酮减少大鼠脑出血周边组织神经细胞凋亡。

　　【关键词】 脑出血;谷氨酸;β内啡肽;细胞凋亡;纳络酮

　　近年来研究证实脑出血周边组织存在长时间的神经细胞凋亡谷氨酸(Glu)、β内啡肽(βEP)与脑出血周边组织细胞凋亡的关系,特别是纳络酮对脑出血保护作用的研究尚有待深入。因此，本研究采用药物干预及多时间点检测生理指标探索脑出血周边组织βEP、Glu含量、神经细胞凋亡变化规律及纳络酮对脑出血周边组织上述指标的影响，为纳络酮治疗脑出血提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 Wistar大鼠112只，体重200～250(平均221±7.9)g，雌雄不限，随机分为脑出血组56只、脑出血+纳络酮干预组56只，两组又各分为出血前、出血后4、6、12、24、72 h、7 d共7个时间点，每时间点各8只。盐酸纳洛酮注射液(优丁林)，购自重庆药友制药有限责任公司。βEP放免药盒由海军放免技术中心生产。Clu标准品由美国Sigma公司提供。原位凋亡检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂为实验室常用分析纯试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组及模型的制备 采用立体定向自体血脑内注入法，参照牛国忠〔1〕报道的方法及Deinsberg等〔2〕方法改进。Wistar大鼠均经10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，俯卧固定于立体定位仪上，头顶部剃毛消毒后正中矢状切开，切口约1.5 cm，钝性分离出前囟，在前囟后1 mm，左旁4 mm处用牙科钻钻一直径约1 mm小孔。距鼠尾末端约2 cm处剪断，取尾血50 μl，将微量注射器推进至已钻孔内，进针5 mm(相当于尾状核部)先注入10 μl，停针2 min后缓慢注入剩余40 μl，2 min后退针1.5 mm停留7 min后缓慢将针完全退出。缝合皮肤，回笼饲养。脑出血+纳络酮干预组于术后即刻、1、2、3 h分别腹腔注射纳络酮5 μg/kg，脑出血组注射等量生理盐水。脑出血前组只进针不注血。大鼠清醒后无偏瘫体征，或血肿沿针道反流，或进入脑室者弃用。

　　1.2.2 检测方法

　　1.2.2.1 Glu含量检测 各组各时间点用乙醚麻醉大鼠，断头处死，冰盘上切取血肿周边脑组织约60～120 mg，加入20倍体积生化检测的冰冷离心缓冲液，冰浴下手动匀浆20次，4℃ 600 r/min离心5 min，取上清液在冰浴中电动匀浆10 min，4℃ 1 500 r/min离心10 min，取上清4℃ 4 800 r/min离心15 min。应用HITACHI83550型氨基酸自动分析仪测定Glu。

　　1.2.2.2 βEP含量测定 各组各时间点用乙醚麻醉大鼠断头处死，迅速取血肿周边组织约0.1 g，分离后称重，每份加入1 mol/L冰醋酸制成匀浆，并加入1 mol/L NaOH 0.5 ml，4℃3 000 r/min离心30 min，上清液置-20℃冰箱中保存，同批放射免疫测定按试剂盒说明书方法操作，计算出样品浓度。

　　1.2.2.3 凋亡细胞的原位检测 TUNEL染色程序按试剂盒内的说明操作，细胞计数，高倍镜下(10×40)每片在血肿周边区、阳性细胞染色区随机选取2个视野，计算每个视野下阳性细胞数，取平均值。

　　1.3 统计学处理 全部检测数据均以x±s表示，采用方差分析及q检验，与脑出血对应时间点比较采取两均数间t检验。

　　2 结果

　　2.1 脑出血周边组织Glu含量变化 脑出血后4 h起，出血周边脑组织Glu含量明显增高，12 h达高峰，持续至7 d，脑出血+纳络酮干预组Glu水平4 h起也明显提高，12 h达高峰，至72 h起恢复正常，治疗组4、6、12、24、72 h Glu水平明显低于脑出血组。见表1。

　　2.2 脑出血周边组织βEP含量变化 脑出血后4 h起，出血周边脑组织βEP含量明显增高，72 h达高峰，持续至7 d，脑出血+纳络酮干预组βEP水平4 h起也明显提高，72 h达高峰，且持续至7 d，脑出血+纳络酮干预组4、6、12、24、72 h βEP水平明显低于脑出血组。见表2。

　　表1 脑出血后不同时间点Glu含量的变化(略)

　　与脑出血前比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与脑出血组对应时间点比较：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

　　表2 脑出血后不同时间点βEP含量的变化(略)

　　2.3 脑出血各组凋亡细胞计数 脑出血后12 h起，出血周边脑组织凋亡细胞数明显增高，脑出血+纳络酮干预组凋亡细胞数12 h起也明显提高，72 h达高峰，脑出血+纳络酮干预组12、24、72 h、7 d凋亡细胞数明显低于脑出血组(见表3)。

　　表3 脑出血后不同时间点凋亡细胞数变化(略)

　　3 讨论

　　脑出血目前仍缺少有效的治疗手段，手术治疗远期效果尚存争议。本实验采用脑出血大鼠模型，多时间点分组，经横向及纵向比较探索Glu、βEP及脑出血周边组织神经细胞凋亡的变化，发现大鼠脑出血后4 h血肿周边脑区Glu含量开始升高，在血肿形成的高峰期12 h达峰值;脑出血后4 h起，出血周边脑组织βEP含量明显增高，72 h达高峰，持续至7 d。大鼠脑出血周边组织6 h出现凋亡细胞，12 h上升显著，3 d凋亡细胞达峰值，7 d时仍存在较多凋亡细胞。纳洛酮干预后Glu 、βEP含量及凋亡细胞数量与脑出血组对应时间点比较显著下降。证明纳络酮通过抑制脑出血周边组织Glu、βEP含量，抑制脑出血周边组织神经细胞的凋亡。

　　3.1 Glu与半暗带神经细胞凋亡 Glu过度增加所致的神经毒性可致脑损害〔3〕。在正常静息情况下，N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体的离子通道内存在Mg2+，能阻断Ca2+内流，该受体的激活至少需3个信号：甘氨酸与NMDA受体结合，谷氨酸与NMDA受体结合，膜去极化。在病理情况下，如缺氧、缺血、低血糖和持续性抽搐等，兴奋性氨基酸(EAA)增加，刺激NMDA受体过度兴奋，启动一系列引起神经细胞损害的细胞内病理生化反应，最终导致神经元的凋亡及变性、坏死。

　　3.2 βEP在脑出血中的意义 βEP是一种强烈的阿片受体激动剂，在应激状态下下丘脑释放因子促使垂体前叶大量释放βEP，血中βEP水平明显升高，可达正常的5～6倍。βEP作为内啡肽类物质，可激活e型阿片受体，使细胞膜Na+K+ATP酶失活，细胞膜失活，细胞膜稳定性破坏而水肿、变性、坏死、功能障碍，明显抑制中枢和周围神经递质的释放和神经元电生理活性，加重意识障碍和中枢神经系统紊乱，甚至死亡〔4〕。

　　3.3 纳络酮的脑保护作用 纳洛酮是阿片受体拮抗剂，可迅速竞争拮抗应激状态下机体释放的大量阿片肽，阻止其与阿片受体结合后产生的病理损害，提高灌注压，改善脑血流，对抗或逆转阿片肽所致的意识障碍〔5，6〕。在脑室或静脉内注射纳洛酮或βEP抗血清，可以减轻脑缺血动物的脑水肿，促进动物和人的瘫痪肢体功能的恢复，并能使人出现一过性意识清醒及定向力的恢复。实验发现，使用纳洛酮，对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。本实验发现，脑出血周边组织存在缺血性损害，类似脑缺血的半暗带，而半暗带的神经细胞损伤主要以凋亡为主。使用纳洛酮后脑出血周边组织Glu、βEP含量与对应时间点脑出血组比较都明显下降，凋亡细胞减少，脑水肿减轻，说明纳洛酮有神经保护作用。

　　【参考文献】

　　1 牛国忠，顾小林，华 洁，等.亚低温治疗实验性大鼠脑出血的保护作用研究〔J〕.中华神经外科杂志，1999;15:28890.

　　2 Deinsberg W，Vogel J，Kuschinsky W，et al.Experimental intracerebral hemorrhage:description of a double injection model in rats〔J〕.Neurol Res，1996;18:4757.

　　3 Dávalos A，Castillo J，Serena J，et al.Duration of glutamate release after acute ischemic stroke〔J〕.Stroke，1997;28(4):70810.

　　4 孟庆林.盐酸纳洛酮的药理与临床应用研究〔J〕.中国急救医学，1994;14(1)：14.

　　5 庄伟端，许端敏，奚宝珊，等.急性脑血管病昏迷患者血浆β内啡肽动态变化及纳洛酮的治疗作用〔J〕.中国急救医学，2003;23(7)：4556.

　　6 曹 辉，李军荣，狄 晴.微创颅内血肿碎吸术合并纳洛酮治疗高血压性脑出血的临床研究〔J〕.临床神经病学杂志，2002;15(1)：4951.