外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑梗死体积和脑细胞凋亡的影响

　　作者：徐爱华 孙芸 柳忠兰 作者单位：中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳 辽宁 110001

　　【摘要】 目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对吸烟大鼠脑梗死体积和脑细胞凋亡的影响。方法 将40只Wister大鼠随机分为正常对照组、长期大量吸烟组(香烟10支×2次/d，90 d)、长期小量吸烟组(香烟5支/d，90 d)、长期大量吸烟+腹腔内注射bFGF组(香烟10支×2次/d，90 d;bFGF 135 μg/kg·w，2次/d，15 d)，每组10只。每组随机取5只大鼠用线栓大脑中动脉法建立脑梗死模型，采用病理图像分析法检测各组大鼠脑梗死体积;采用免疫组化法和TUNEL法检测脑内p53表达和细胞凋亡。结果 各吸烟组大鼠脑梗死体积较正常对照组明显增加，其中长期大量吸烟组脑梗死相对体积加权值为0.531±0.025，长期小量吸烟组为0.478±0.034，长期大量吸烟组+bFGF组为0.492±0.018，正常对照组为0.462±0.030，各组比较有显著差异(P<0.05);各吸烟组脑内p53表达及脑细胞凋亡较正常对照组均明显增多，其中以长期大量吸烟组p53及凋亡细胞灰度值为112.796±13.183、105.596±1.472，长期小量吸烟组为128.179±1.445、112.373±2.736;长期大量吸烟+bFGF组为143.095±1.873、135.568±1.258，正常对照组为184.227±3.438、177.134±2.038，各组比较有统计学差异(P<0.01)。结论 吸烟可使脑梗死体积增加，脑内p53及细胞凋亡增加，并且与吸烟剂量呈正相关。外源性bFGF可减小脑梗死体积，并通过抑制p53表达来抑制细胞凋亡。

　　【关键词】 外源性碱性成纤维细胞生长因子; 吸烟 脑梗死体积 凋亡

　　The effect of ectogenous basic fibroblast growth factor on cerebral infarction volume and apoptosis in the smoking rats

　　XU AiHua, SUN Yun, LIU ZhongLan.

　　Department of Neurology, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning, China

　　【Abstract】 Objective To study the effect of exogenous basic fibroblast growth factor (bFGF) on cerebral infarction volume and cell apoptosis in the smoking rats. Methods 40 rats were randomly grouped into normal control, longterm massive, longterm trifle and bFGF (abdominal cavity injection) treated longterm massive groups, 10 rats for each group. 5 rats were randomly selected from each group to establish MCAO model, detect infarction volume of each group by pathological image analysis, and p53 expression and apoptosis were detected in other rats by immunohistochemistry and TUNEL method respectively. Results The infarction volume of all the smoking groups were significantly enlarged compared with that of normal group, relative volume weighted value in longterm massive, trifle, longterm massive+bFGF and normal control groups was 0.531±0.025, 0.478±0.034, 0.492±0.018 and 0.462±0.030, respectively, having significant difference between each group (P<0.05). The p53 expression and apoptosis in all the smoking groups were significantly increased compared with those of normal group, p53 expression and apoptosis gradation in longterm massive, trifle, longterm massive+bFGF and normal control groups were 112.796±13.183 and 105.596±1.472, 128.179±1.445 and 112.373±2.736, 143.095±1.873 and 135.568±1.258, 184.227±3.438 and 177.134±2.038, respectively; having significant difference between each group (P<0.01). Conclusions Smoking could enlarge cerebral infarction volume, increase p53 expression and apoptosis, and it has positive correlation to smoking doses. Exogenous bFGF could reduce cerebral infarction volume, and depress apoptosis by depressing p53 expression.

　　【Key words】 Exogenous basic fibroblast growth factor (bFGF); Smoking; Cerebral infarction volume; Apoptosis

　　研究证实，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡〔1〕。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有多种生物学活性的多肽生长因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用，被认为是很有临床应用价值的一种神经营养因子。 目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟引起的缺血性脑血管病的影响的报道。本研究通过腹腔内注射bFGF，对大鼠脑梗死体积进行比较，并对大鼠脑细胞凋亡及其相关基因p53的表达进行检测，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑梗死的脑保护作用及其可能机制，为bFGF的临床应用提供更充分的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 健康成年雄性Wistar大鼠40只(由中国医科大学实验动物中心提供)，体重250～300 g。随机分为长期大量吸烟组、长期小量吸烟组、长期大量吸烟+bFGF组、正常对照组，每组10只。饲养室内温度、湿度保持恒定，自然光照，自然通风，大鼠可自由接触食水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂 实验用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自北京白鹭源生物技术责任有限公司。p53抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、凋亡试剂盒均购自武汉博士德生物制品实验有限公司。尼古丁含量为1.5 mg/支的市售某品牌香烟。

　　1.2.2 模型制备 将各吸烟组大鼠均置于80 cm×60 cm×40 cm大小的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。长期大量吸烟组燃烧香烟10支×2次/d，共90 d;长期小量吸烟组燃烧香烟5支/d，共90 d;长期大量吸烟+bFGF组吸烟量及时间与长期大量吸烟组相同。用于梗死体积测定的大鼠于梗死术后开始注射，共7 d，其余于吸烟最后15 d腹部注射bFGF。脑梗死模型制备：将大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后，仰卧于手术台上，四肢线绳固定。于颈部正中切开皮肤及皮下组织，暴露并分离右侧颈总动脉(CCA)，结扎CCA的近心端，向上分离右侧颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。继续沿ICA向上分离翼腭动脉(PPA)，分离后不结扎。在近CCA分叉处结扎ECA，用小动脉夹夹住CCA的远心端，在此处放一打好结的丝线，暂时不收紧丝线。在丝线下端用眼科剪剪一小口，插入长度约1 cm，直径约0.5 mm左右的聚乙烯管后，在管中插入已制备好的栓线，撤去聚乙烯管。收紧丝线以防止其中的栓线滑出和出血，松开动脉夹，沿CCA经ICA将栓线缓慢送至颅内，遇阻力而止，稍微回撤。以分叉处为标记，栓线插入长度为(19.0±0.1)mm，此时栓线头正好位于大脑中动脉(MCA)的起始部位。缝合切口。待大鼠苏醒后参考Loga法对大鼠术后神经功能进行评分，以检测脑梗死程度。

　　1.2.3 给药方法 除对照组大鼠外，其余各组大鼠采用浓度为200 μg/ml的bFGF按135 μg/kg·w经腹腔内注射给药，每日2次，用于免疫组化检测的大鼠连续给药15 d，用于脑梗死体积测定的大鼠于梗死术后开始注射，每日2次，连续7 d。

　　1.2.4 检测指标 大鼠大脑中动脉梗死模型及脑梗死体积测定：用颈椎脱位法处死大鼠后取脑，自额极开始冠状切片，片厚约2 mm，浸入2%的TTC染色溶液中37℃孵育30 min。采用病理图像分析系统测量脑梗死相对体积(脑梗死相对体积=平均梗死横截面积×脑切片层数×层厚/大脑总体积)。为了抵消脑水肿对体积测量的影响，梗死处的横截面积用梗死对侧的脑横截面积减去梗死同侧正常组织的截面积求得，将所求得的相对体积百分比进行加权使其呈正态分布。p53的免疫组化染色：切片常规脱蜡入水,0.3%过氧化氢37℃作用10 min灭活内源性酶。0.01 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压修复2 min左右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37℃，20 min。加p53抗体，4℃过夜。PBS洗5 min，3次，加生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育 20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37℃，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。细胞凋亡的检测：切片依次经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K20 μg/ml 37℃消化15 min，TBS(pH7.4)洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液(TdT 1μl，DIGdUTP 1 μl，18 μl标记缓冲液，20 μl/片)，37℃孵育2 h。TBS洗2 min，3次，加生物素化地高辛抗体，37℃孵育30 min，TBS洗2 min，3次，DAB显色，苏木素复染。TBS洗。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉TdT酶，其余操作同上。

　　1.3 统计学处理 用显微成像系统采集图片，计算并分析p53及凋亡阳性细胞平均灰度值，采用SPSS11.5软件对各组数据进行单因素方差分析(ANOVA)，组间变量行两两比较的SNK法分析。

　　2 结果

　　2.1 脑梗死体积 见图1。经TTC染色的正常脑组织为红色，梗死脑组织为白色。各吸烟组脑梗死体积较正常对照组明显增大(P<0.05)，其中长期大量吸烟组最明显，长期大量吸烟+bFGF组次之。

　　1 正常对照组 2 长期大量吸烟+bFGF组　3 长期小量吸烟组 4 长期大量吸烟组

　　图1 Mean相对体积的加权数(略)

　　2.2 p53表达 见图2、表1。光镜下可见核为蓝色、胞浆为棕色的p53阳性细胞。各吸烟组p53阳性细胞较正常对照组明显增多，其中长期大量吸烟组最明显(P<0.01)。

　　1 长期大量吸烟组 2 长期小量吸烟组　3 长期大量吸烟+bFGF组 4 正常对照组

　　图2 各组p53阳性细胞免疫组化染色(略)

　　表1 吸烟大鼠脑内凋亡细胞及p53阳性细胞平均灰度(略)

　　与正常对照组比较:1)P<0.01;与长期大量吸烟组比较：2)P<0.01;与长期大量吸烟+bFGF组比较：3)P<0.01

　　2.3 细胞凋亡情况 见图3、表1。镜下凋亡细胞阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小体。各吸烟组凋亡细胞较正常对照组明显增加，其中长期大量吸烟组最明显(P<0.01)。

　　1 长期大量吸烟组 2 长期小量吸烟组　3 长期大量吸烟+bFGF组 4 正常对照组

　　图3 各组脑细胞凋亡TUNEL染色(略)

　　3 讨论

　　香烟中含有的烟碱(尼古丁)、镉、苯并芘、氧化剂和自由基等成分，可引起、促进或扩大氧化损害〔2〕，而氧化损伤可直接引起细胞凋亡。本研究观察到各吸烟组大鼠脑细胞凋亡均明显高于正常对照组，并与剂量呈正相关，与以往吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡〔1〕的报道相一致。

　　p53基因是已知的促凋亡基因，同时也是缺血损伤时敏感而可靠的标志，缺血缺氧、DNA损害均能刺激其表达明显增加。本研究观察到各吸烟组大鼠脑内p53阳性细胞较正常对照组明显增多，与吸烟剂量呈正相关，并与凋亡细胞分布一致。我们认为吸烟可能通过诱导促凋亡基因p53表达增加来促进细胞凋亡。

　　bFGF是一种具有多种生物学活性的多肽，正常情况下脑内只有轻度的bFGF表达，但在大脑发育期、损伤或中风发生时表达水平上调〔3〕。采用放射性标记的bFGF检测，发现在正常情况下，外源性bFGF不能通过血脑屏障，而当脑组织受到各种损伤时，bFGF则能通过受损的血脑屏障发挥其神经保护作用〔4〕。本研究发现吸烟后腹腔内注射bFGF大鼠的脑梗死体积、脑细胞凋亡数较单纯吸烟大鼠均明显减少，促凋亡基因p53表达也明显降低降低，说明吸烟导致血脑屏障受损，外源性bFGF可通过受损的血脑屏障，对吸烟引起的脑组织损伤发挥一定的保护作用。bFGF的脑保护作用可能通过多种途径实现：(1)bFGF可增加两种重要的抗氧化酶Cu/Zn过氧化物歧化酶和谷胱还原酶的活性，对抗缺血后的谷氨酸兴奋毒性损伤〔5〕。(2)bFGF能抑制海马神经元内一种71Kda NMDA受体相关蛋白表达〔6〕，对抗NMDA的神经毒性。近来研究还表明，bFGF能增加NMDA受体拮抗剂(MK801)的抗缺血后神经损害作用〔7〕。(3)细胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素，bFGF能维持细胞内Ca2+内环境稳定，阻止Ca2+内流〔8〕。(4)bFGF还有降低NO神经毒性的作用〔9〕。(5)bFGF直接营养胶质细胞、血管和神经元，可作为胶质营养因子促进胶质细胞分化，又可作为血管源性因子促进脑血管内皮细胞及血管增生，以抵抗缺血的损伤。

　　综上，我们认为吸烟可使脑梗死体积增大，并通过诱导促凋亡基因P53表达增加促使细胞凋亡的发生，从而导致损伤。而外源性bFGF可减小脑梗死体积，通过下调P53蛋白的表达，阻断凋亡信号传导通路，在一定程度上抑制凋亡发生，起到脑保护作用，但bFGF最佳作用剂量及临床应用的远期效果尚需进一步观察研究。

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