葛根素对大鼠缺血脑组织EPO表达的影响

　　作者：罗玉敏 高利 吉训明 刘萍 宋珏娴 党莎 李宁 刘倩 作者单位：首都医科大学宣武医院脑血管病研究室 宣武医院神经内科，北京 100053

　　【摘要】 目的 探讨葛根素对大鼠脑缺血后脑促红细胞生成素(EPO)表达的影响。方法 应用线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注48 h损伤模型;分别于缺血2 h再灌注即刻、再灌注24 h给予腹腔注射葛根素400 mg/kg(体重)，对照组腹腔注射等剂量生理盐水，每组12只大鼠。大鼠苏醒后30 min及处死前分别进行神经功能评分。48 h处死大鼠，每组6只石蜡切片用HE染色检测腔梗死体积，免疫组织化学检测葛根素对缺血脑组织EPO表达的影响;每组6只ELISA法检测EPO活性。结果 葛根素400 mg/kg(体重)腹腔注射组的脑梗死体积明显小于对照组，葛根素治疗也可减少神经功能损伤，神经功能评分均明显好于对照组。免疫组织化学结果显示：葛根素组大鼠脑缺血侧皮层区及基底区EPO阳性细胞数明显高于对照组。结论 葛根素对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。其保护作用可能与提高EPO的表达有关。

　　【关键词】 葛根素;缺血再灌注;EPO

　　Effects of puerarin on EPO expressions in ischemic brain tissues of rats following MCAO

　　LUO YuMin, GAO Li, JI XunMing, et al.

　　Cerebrovascular Diseases Research Institute, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100053, China

　　【Abstract】 Objective To test whether Chinese medicine puerarin has effects in erythropoietin (EPO) expression in rats following middle cerebral artery occlusion (MCAO). Methods Ischemiareperfusion injury (I/R injury) was induced by ligated MCAO with 2 h ischemia and 48 h reperfusion. 400 mg/kg puerarin or saline (control) were administered intraperitoneally at two points: immediately and 48 h after reperfusion. The rats were sacrificed 48 h after reperfusion. Infarct volume was measured through triphenyl tetrazolium chloride (TTC) staining. The EPO expressions were determined by immunohistochemistry. Functional neurological outcome was determined at 30 min and 48 h after the rats awake from the surgery. Results Compared to control group, the infarct volume of 400 mg/kg puerarin group decreased obviously. The puerarintreated group had better functional neurological outcome compared to the controls. The EPO expressions were increased obviously in puerarintreated group. Conclusions Puerarin has neuroprotective effects on rats with I/R injury, one of the underlying mechanism may through increasing EPO expressions during I/R injury.

　　【Key words】 Puerarin; Ischemia reperfusion injury; Erythropoietin (EPO)

　　脑血管病具有高发病率、致残率和死亡率的特点，并呈现发病年轻化的趋势，成为威胁人类健康的主要疾病之一〔1〕。急性脑卒中的治疗除了早期溶栓治疗外几乎无特殊治疗方法，而且溶栓治疗有严格的时间窗限制，且并发症很多。因此中药在脑缺血治疗中的研究很多。许多学者发现葛根素可以抵抗脑缺血损伤，其机制可能与很多靶点有关。近来发现促红细胞生成素(EPO)具有脑缺血保护作用，但是由于外源性EPO的应用产生了很多副作用，如促进红细胞、血小板增生等，从而限制了其应用。本研究旨在探讨葛根素是否影响脑缺血后内源性EPO的表达。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　SPF级Sprague Dawley(SD)雄性大鼠24只，体重280～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证：SCXK(京)20070001。饲养于恒温净化通风动物房,自由进食和饮水,室温保持(25±2) ℃。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　恩氟烷 (Enflurane，河北九派制药);葛根素注射液(批号H20010180，山东瑞阳制药有限公司)，山羊抗EPO多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，ELISA检测试剂盒〔Rapidbio (R&B)，美国〕。石蜡切片机(Leica 2235，德国)、血气电解质分析仪(iSTAT，美国)。脑血流监测仪(PERIMED，PF5001，瑞典)、小动物呼吸机(Harvard Apparatus 683，美国)、小动物麻醉机(BACKFORD 61010，美国)、手术显微镜(Carl Zeiss，德国)、反馈式温度调节仪(Harvard Apparatus，美国)、有创血压监测仪(BIOPAC MP100ACE，美国)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 动物模型的制作

　　参考Longa 等〔2〕的制作大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠称重后4%恩氟烷诱导麻醉，1%～2%恩氟烷混合70%N2和30%O2维持麻醉。应用激光多普勒监测大鼠大脑中动脉分布区的血流量。选择右侧大脑中动脉进行线栓，术中小心分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，使用自制的线栓，由颈外动脉残端插入颈内动脉，至距颈内动脉和颈外动脉分叉处约1.8～1.9 cm。栓塞2 h后拔除栓子制备缺血2 h再灌注损伤模型。术中监测肛温、血糖、血气及血压。葛根素组缺血2h再灌注即刻、再灌注24 h分别给与葛根素腹腔注射 400 mg/kg体重，对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水2次。

　　1.3.2 神经功能评分

　　参照Belayev等〔3〕提出的12分评分法：(1)姿势反射测验，即提尾悬空试验：无明显神经功能缺失为0分，梗死对侧肢体屈曲为1分，侧推试验阳性为2分。(2)肢体放置试验。①视觉亚实验，即前方刺激——实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近(此时桌子位于大鼠前方)，正常大鼠反应为前肢即刻抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0分：动物肢体放置反应正常;1分：反应延迟但不超过2 s;2分：反应延迟且超过2 s。侧方刺激，此时桌子位于动物侧方，其余实验方法及评分标准同前方刺激。②触觉亚实验，将动物双眼遮住，并使其前爪悬空，此时大鼠应该既看不见，也不能用胡须触及桌面，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达到皮肤和毛发，动物反应及评分同视觉亚实验，触觉刺激同样分前方及侧方刺激。③本体觉亚实验，操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同，本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节。该亚实验只有前方刺激。动物前肢放置实验总分范围为0～10分，功能损伤越重，得分越高。

　　1.3.3 脑梗死体积的测定

　　脑缺血再灌注48h后处死大鼠，取脑，固定，在大鼠脑模型内由额极向后均匀切成2 mm厚的冠状脑片，去除额极脑片，石蜡依次包埋余下5个脑片，之后每个蜡块切取一张，HE染色，拍照，使用ImagePro Plus Analysis Software计算机图像分析系统计算梗死体积百分比=(非缺血侧体积-缺血侧正常脑组织体积)/非缺血侧体积×100%，非缺血侧体积或者缺血侧正常脑组织体积=(S1+S2+S3+S4+S5)×2 〔S表示每片应该计算的面积，2表示每片厚度(mm)〕。

　　1.3.4 免疫组织化学染色

　　取材后常规石蜡包埋切片，脱蜡至水，PBST洗涤;3% H2O2/甲醇室温孵育30 min;样品通透液冰浴下通透5 min，滴加封闭用兔血清工作液，室温放置1 h，倾去，勿洗;滴加1∶150比例稀释的一抗(Goat AntiEPO，Santa Cruz Biotechnology，Inc.SC6480)，4℃过夜;阴性对照以PBS替代一抗;滴加兔抗山羊二抗工作液，置于室温2 h;滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，置于室温45 min，以上每步均经PBST充分洗涤;DAB(Vector laboratories,Inc,SK4100)染色，参照使用说明。苏木素复染。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片、光镜下观察。阳性细胞为棕黄色或棕褐色，细胞浆着色。采用Motic Med BA600生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，在100倍视野下选取皮层和基底节固定的3个视野(如图1所示:Ⅰ代表皮层,Ⅱ代表基底节)，计数EPO阳性细胞数，取其平均值。

　　1.4 统计学处理

　　所有资料用x±s表示，统计学分析采用SPSS11.5统计软件。均数间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 葛根素对大鼠神经功能评分的影响

　　两组大鼠术后均出现神经功能缺陷症状，大多数表现为不同程度的对侧前肢屈曲，行走路径向缺血对侧偏斜，于手术苏醒后30 min以及处死前测定神经功能，结果表明：术后30 min两组神经功能评分差异有统计学意义，葛根素组神经功能评分明显低于对照组(P<0.05)，处死前与对照组比较神经功能评分葛根素组减低，但没有统计学差异，考虑与大鼠自身功能的恢复有关(见图2)。

　　2.2 葛根素对大鼠脑梗死体积的影响

　　对照组大鼠脑组织出现大面积梗死，梗死范围涉及皮层、皮层下区、纹状体等。葛根素组脑梗死体积明显减小，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.001)(图3)。

　　2.3 葛根素对大鼠缺血脑组织EPO表达的影响

　　大鼠脑缺血再灌注48 h，葛根素组大鼠缺血侧皮层及基底节区EPO的表达均明显高于对照组(均P<0.05，见图4及图5)。

　　3 讨 论

　　葛根素(puerarin) 是从中药葛根中提取的异黄酮类化合物，现已广泛应用于缺血性心脑血管病的治疗。现代药理学研究发现其主要成分是黄酮类物质,总量可达12%,由葛根素、黄豆苷及黄豆苷元等组成。具有扩张冠状动脉和脑血管改善微循环抗氧化、清除自由基和对缺血再灌注损伤保护等作用〔4〕。许多实验表明葛根素有抗缺血再灌注损伤作用，但多是从其可清除自由基、抗脂质过氧化、降低细胞内Ca2+含量、抑制诱生型NO 合酶系统的激活、干预细胞凋亡以及抑制炎症反应等角度来探明其作用机制的〔5～7〕。

　　EPO是一种糖蛋白激素，其分子量约为34 kD。人类EPO基因位于7号染色体长臂22区。天然生成的EPO分两种：α型和β型。α型含34%的碳水化合物,β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。以前的研究认为EPO仅具有促红细胞生长作用，被临床广泛应用于肾性贫血的治疗。最近的研究发现，EPOEPO受体结合而介导的细胞信号通路不仅是促进红细胞增殖分化的原因，而且它们对由脑缺血引起神经细胞损伤具有保护作用,且有关内源性及外源性EPO的神经保护作用机制的研究也很多〔8〕。EPO对脑缺血情况下神经元的保护已在动物模型和细胞培养模型中得以证实〔8〕。EPO在脑缺血保护中可同时开启多个细胞信号通路〔9〕，本文仅探讨了葛根素对大鼠脑缺血后EPO表达的影响，发现葛根素可以提高脑缺血后内源性EPO的表达，因此，我们推测葛根素对大鼠脑缺血损伤的保护作用可能也通过了刺激EPO表达而起作用。

　　【参考文献】

　　1 Corbett D，Hamilton M，Colbourne F.Persistent neuroprotection with prolonged postischemic hypothermia in rats subjected to transient middle cerebral artery occlusion〔J〕.Exp Neurol，2000;163(1)：2006.

　　2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S,et

　　al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕 Stroke，1989;20(1):8491.

　　3 Belayev L，Alonso OF，Busto R,et al.Middle cerebral occlusion in the rat by intraluminal suture〔J〕.Stroke，1996;27：161623.

　　4 潘洪平.葛根总黄酮和葛根素的药理作用和临床应用研究进展〔J〕.广西医学，2003;25(10)：19414.

　　5 潘洪平，杨嘉珍，李吕力，等.葛根素注射液对急性血瘀模型大鼠血液流变性改善作用的实验研究〔J〕.中国中药杂志，2003;28(12)：117880.

　　6 潘洪平，杨嘉珍，莫祥兰，等.葛根素注射液对急性脑缺血模型大鼠脑细胞损伤的保护作用〔J〕.中国中药杂志，2003;130(6)：4579.

　　7 潘洪平，莫祥兰，杨嘉珍，等.葛根素对大鼠急性脑缺血损伤Hsp70表达的影响〔J〕.中国中药杂志，2005;130(7)：53841.

　　8 Brian A.Kellert，Ronald JM,et al.A comparison of highdose recombinant erythropoietin treatment regimens in braininjured neonatal rats〔J〕.Pediatr Res，2007;61(4):4515.

　　9 Kilic E，KiliU，Soliz J,et al.Brain derived erythropoietin protects from focal cerebral ischemia by dual activation of ERK 1/ 2 and pathways〔J〕.FASEB J，2005;19(14)：20268.