2号、18号染色体微卫星多态性与甲状腺癌的关系

　　作者：翟瑜,苏力,王春城,檀碧波,脱红芳,郭贵　　作者单位：河北省人民医院，河北 石家庄 050021

　　【摘要】目的 探讨特定位点微卫星DNA序列不稳定性(MSI)及杂合性缺失(LOH)与人甲状腺癌发生、临床病理特征及预后的关系。方法 选取THRA1、D2S123、D11S912、BAT26四个位点，应用聚合酶链反应(PCR)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对60例人甲状腺癌患者的MSI及LOH表达情况进行研究。结果 THRA1位点MSI检出频率为43.3%，D2S123为36.7%;甲状腺滤泡癌中D2S123检出率为100%，未检测到BAT26;D18S58的检出率为26.7%;BAT26在甲状腺癌中检出率为6.7%;LOH 的检出率分别为33.3%、26.7%、23.3%和16.7%。术后随访5年，MSI/LOH阳性的甲状腺癌较阴性者生存期更长(P<0.05)。 结论 在2号和18号染色体中检测到微卫星阳性率较高;D2S123位点MSI与滤泡型甲状腺癌相关性有统计学意义;D18S58位点MSI的阳性率与高龄患者、晚期肿瘤密切相关;BAT26在甲状腺癌中检出率最低。MSI/LOH导致基因组不稳定，在甲状腺肿瘤发生过程中发挥作用。MSI/LOH阳性的甲状腺癌患者较阴性者生存期更长。

　　【关键词】 甲状腺癌,MSI,PCR;肿瘤

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the microsatellite instability (MSI) and the loss of heterozygosity (LOH) in thyroid carcinoma and the occurrence, clinic pathological features and prognosis. Methods THRA1, D2S123, D11S912 and BAT26 site point were selected and analyzed by PCR and degenerative polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The expressions of MSI and LOH in 60 patients with thyroid carcinoma were measured and the patients 5year survival rate were counted. Results The most frequent MSI was observed at THRA1 with an incidence of 43.3% (26/60), MSI on D2S123 was detected in 36.7% (22/60) of the tumor. In follicular cancer, MSI in D2S123 occurred at a frequency of 100% (12/12), 0% in BAT26 and 26.7% in D18S58. BAT26, which was an important marker in colorectal cancer, displayed the lowest frequency of MSI in the detected thyroid tumors 6.7% (4/60). The expression rate of LOH was 33.3% (20/60), 26.7% (16/60), 23.3% (14/60) and 16.7% (10/60) respectively.By 5years followup visit, patients with MSI/LOHpositive cancer showed better longterm survival (P=0.007). Conclusions The high frequency of MSI can be detected at both 2p and 18q loci. It is identified that there are correlations between MSI on D2S123, D18S58 chromosome and clinical pathologic characteristics. The link between MSI in D2S123 and follicular carcinoma is calculated to be statistically significant. The correlation between MSI in D18S58 and patient age, terminal tumor is significant. This finding of the low frequency of MSI in BAT26 suggests that the biochemical defects governing the spectrum of MSI in thyroid and colorectal cancer are different. MSI/LOH leads to the instability of the genome, has the notable significance in occuring of the thyroid tumors. Patients with MSI/LOH positive cancer have better longterm survival.

　　【Key words】 Thyroid carcinoma; MSI; PCR; Tumor

　　甲状腺癌来源于上皮滤泡细胞或滤泡旁C细胞〔1〕，目前多根据患者年龄、肿瘤大小和病理特征确定潜在的风险，制定治疗方案〔2〕。人类肿瘤多与基因不稳定有关，微卫星(microsatellite，MS)、微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)，是继癌基因和抑癌基因之后，研究肿瘤发生、发展和预后方面的又一热点。MSI最早发现于遗传性非息肉性结肠癌(Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer，HNPCC)，错配修复(mismatch repair，MMR) 基因的突变是导致MSI的直接原因〔3〕。关于甲状腺癌MSI和杂合性缺失(LOH)的研究，国内还未见报道。本文选取THRA1、D2S123、D11S912、BAT26四个位点，检测人甲状腺癌标本MSI表达情况，探讨MSI、LOH与人类甲状腺癌生物学行为之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 甲状腺癌手术切除标本共60例，男28例，女32例;年龄42～72岁(平均62.2±13.2岁)。每一病例取肿瘤中心部位的癌组织，同时取甲状腺良性病标本60例作为正常对照。离体标本手术切除后立即置于液氮中，然后转移至-80℃低温冰箱中保存。

　　1.2 引物设计 选取THRA1，D2S123，D18S58，BAT26四个基因位点，其引物设计参考Gene Bank(表1)，由上海生工生物工程公司合成。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本基因组DNA的提取 酚-氯仿异戊醇法提取基因组DNA，溶于TE缓冲液，-20℃保存。

　　1.3.2 DNA的浓度测定及纯度判定 取1.5 μl DNA溶液，用无菌蒸馏水稀释1 000倍，以蒸馏水做空白对照，在紫外分光光度计上读取A280和A260的光密度值。DNA浓度(μg/ml)=(A260×50×稀释倍数)/1 000;DNA纯度的测定：A280/A260比值介于1.7～2.0。

　　1.3.3 MSI位点引物的PCR扩增 PCR反应体系(体积25 μl)： 3种DNA引物各6 pmol，dNTPs (美国Promega公司)200 μmol/L，TrisCl (pH 8.3)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司) 0.25 U，DNA 100 ng，Ci 〔α32P〕 dCTP (特殊活性：4 000 Ci/mmol) (BRIT公司，印度)2 U。将反应管置于PCR扩增仪中，按下列条件进行扩增：预变性：94℃，3 min;变性：94℃，40 s;退火：54～60℃，40 s;延伸：72℃，40 s;30个循环;72℃延伸5 min。

　　1.3.4 PCR产物的电泳及显色 将PCR产物8μl与等量6×凝胶加样缓冲液(95% 甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05% 二甲苯蓝)混合，95℃变性3 min，加样于7%变性聚丙烯凝胶，在55 W电压下进行电泳2 h。电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，切断电源，将凝胶小心剥入EB溶液中，室温染色30 min。弃去EB溶液，用三蒸H2O冲洗凝胶3次，将凝胶移至

　　凝胶呈像系统光源上，观察摄影。

　　1.4 结果判定 将肿瘤组织与相应正常组织PCR产物同时上样比较，若肿瘤组织的某一等位基因出现条带的增多或位置的改变，则记录为MSI;若等位基因完全缺失或密度降低70%以上，则记录为微卫星LOH。

　　1.5 随访 统计其生存率，所有患者术后随访5年。

　　1.6 统计学处理 采用χ2检验，应用KaplanMeier生存曲线法和时序检验统计其生存率。以实验数据的95%可信区间为正常值范围。数据处理通过统计软件SPSS10.0完成。

　　2 结 果

　　2.1 微卫星DNA多态位点MSI、LOH的表达 甲状腺癌及正常组织中，26例在THRA1位点出现MSI，为43.3%，频率较高;22例在D2S123位点出现MSI，为36.7%，12例甲状腺滤泡癌中，D2S123的表达率为100%，而没有检测到BAT26表达;16例在D18S58位点出现MSI，为26.7%;BAT26在甲状腺癌中检出率最低，为6.7%;LOH在THRA1、D2S123、D18S58和BAT26的表达分别为33.3%，26.7%，23.3%及16.7%(表2)。表1 MSI引物序列表2 甲状腺癌组织MSI、LOH阳性率

　　2.2 MSI、LOH与甲状腺癌临床病理特征的关系 10例滤泡型甲状腺癌D2S123位点MSI均呈阳性，而非滤泡型甲状腺癌在D2S123位点MSI的阳性率为36.0%(18/50)。D2S123位点MSI的表达与滤泡型甲状腺癌之间的关系有统计学意义(P<0.05)。而在28例甲状腺良性疾病甲状腺滤泡性腺瘤中，D2S123位点MSI的阳性率为7.1%(2/28)(P<0.001)，提示D2S123位点MSI与滤泡型甲状腺癌有明显相关性。D18S58位点MSI的阳性率，在>70岁的患者中为50%(4/8)，<70岁的患者中为15.4%(8/52)。D18S58位点MSI的阳性率与患者年龄间有统计学意义(P<0.05)。D18S58在N3、N4期肿瘤中的阳性率为38.5%(12/32)，高于N0、N1、N2中的阳性率14.3%(4/28)，具有统计学意义(P<0.05)(表3，图1，图2)。未发现LOH与甲状腺癌临床病理特征之间有关。

　　图1 甲状腺癌组织基因组DNA表3 MSI与甲状腺癌临床病理类型之间的关系

　　位点临床病理参数样本量出现例数MSI阳性率(%)P值D2S123病理类型滤泡型癌1010100<0.05其他类型癌501836.0滤泡性腺瘤2827.1<0.000 1D18S58年龄>70岁8450<0.05<70岁52815.4病理分期N0228414.3<0.05N3,4321238.5

　　2.3 MSI、LOH与甲状腺癌患者预后的关系 对甲状腺癌患者术后随访5年，失访4例。将56例患者分为在任一位点均无表达的MSI/LOH阴性组和至少在一个位点有表达的MSI/LOH阳性组。20例术后肿瘤复发，其中MSI/LOH阳性4例，MSI/LOH阴性16例。14例死于复发的甲状腺肿瘤(14/56,25.0%)，其中MSI 0例，LOH 4例，MSI/LOH阴性10例。36例患者生存5年以上，无明显复发征象(36/56,64.3%)，而MSI/LOH阳性 26例。MSI/LOH阳性率与甲状腺癌患者术后5年生存率之间存在明显统计学意义(P=0.007)(图3)。N：正常甲状腺组织;M：MSI等位基因增多或移位的条带;L：LOH 等位基因消失的条带

　　3 讨 论

　　近年来，在参与肿瘤发生、发展的相关基因中，除癌基因和抑癌基因外，另一种癌相关基因，即错配修复基因(mismatch repair gene，MMR)越来越成为学者们研究的热点，而作为MMR突变子表型的微卫星DNA序列MSI〔4〕更成为研究中的焦点。

　　3.1 MSI、LOH及其产生的原因 MS广泛存在于原核及真核基因组中，具有高度多态性，MS由2～6个核苷酸组成，多位于基因编码区附近，也可位于内含子和启动子中〔5〕，遵循孟德尔遗传规律，呈遗传稳定性，通过改变DNA结构和与特异性蛋白结合发挥基因调控作用，是基因重排和变异的来源〔6〕。

　　MSI是由DNA复制错误引起的简单重复序列的改变，表现为肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变〔7〕。MSI最早在1993年发现于HNPCC，后又陆续在胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、小细胞肺癌等肿瘤中发现〔8〕。迄今为止，几乎每一类型的肿瘤有MSI的存在〔9〕。产生MSI的主要原因是MMR功能缺陷，不能正常地发挥错配修复作用。MMR缺陷所致的MSI通过DNA的复制和细胞分裂而被保存在基因组中，增加了其他基因的不稳定性，进而出现整个基因组的不稳定性，导致细胞增殖及分化异常，从而促进肿瘤的发生。

　　某等位基因的基因型由杂合状态变为半合性、纯合性、或零和性称为LOH。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段缺失。染色体上特异性等位基因丢失，是人类肿瘤基因组中常见的遗传学改变。MS多态位点与抑癌基因紧密连锁，探讨LOH现象，有助于研究肿瘤发生发展过程中的隐性遗传变化及其机制〔10〕。现已证明，某些野生型基因的特异性丢失(或失活)，保留或复制了突变性等位基因，在特定肿瘤的发生、发展过程中具有因果关系。因此，检测出这些基因位点的LOH，进而克隆出有关的抑癌基因，对深入研究肿瘤的发病机理，开展肿瘤预测，开拓基因治疗途径具有重要而深远的理论和实践意义。

　　3.2 甲状腺癌BAT26、THRA1位点MSI的生物学意义 在大肠癌中，BAT26位点MSI的表达是可靠的预测因素，可预测MSI在其他位点的发生，并在MSI发生过程中具有极强的程序性价值〔11〕。BAT26位于hMSH2基因内含子5，在hMSH2介导的错配修复体系中，MSI阳性是大肠癌错配修复缺陷的证据，具有重要意义〔12〕。而本研究表明，在直肠癌中高表达的BAT26在甲状腺癌中检出率最低，为6.7%，甲状腺滤泡癌中没有检测到BAT26。BAT26位点MSI阳性率最低，其预测价值也最低。可见，BAT26在甲状腺癌中的生化特点与大肠癌中并不相同。从本实验结果看，MSI阳性的甲状腺癌患者，其预后明显好于MSI阳性的大肠癌患者。尽管其确切机制尚不清楚，但有研究表明，MSI阳性所携带的基因改变可减少侵袭性的表型〔13〕。本研究中甲状腺癌THRA1位点的MSI阳性率最高，THRA1基因是显性负向癌基因verbA的同系物。对癌细胞系免疫组化分析表明〔14〕，THRA1位点的MSI，位于基因外显子9，影响THRA1蛋白的表达。尽管没有找到THRA1与临床病理特征之间的关系，可以认为，THRA1位点MSI是产生甲状腺癌生化事件的标志点。

　　3.3 甲状腺癌MSI在D2S123和D18S58位点的检出率及意义 本研究所选择的D2S123和D18S58两个染色体位点均有较高的MSI、LOH检出率。D2S123位点MSI在甲状腺滤泡癌的检出率更是高达100%，提示D2S123是甲状腺滤泡癌相关的发生基础。D18S58的检出率为26.7%。Masamitsu等〔15〕在D2S399、D2S115位点检测到MSI的阳性率为14.3%和22.4%，而在甲状腺滤泡癌中，未检测到D2S399、D2S115的表达。提示在单发的甲状腺癌中，MSI在2号染色体的表达并不一致。2号染色体，尤其是D2S123位点，在研究甲状腺癌MSI表达的意义有重要的价值。

　　3.4 甲状腺癌MSI、LOH在基因治疗中的意义 本研究选取的位点THRA1、D2S123有其各自的特点。THRA1位点MSI阳性率最高，而THRA1位点MSI阳性的患者在其他位点发现MSI阳性的机率也高于阴性患者〔16〕;在直肠癌中高表达的BAT26在甲状腺癌中检出率最低，甲状腺滤泡癌中没有检测到BAT26。D2S123位点MSI阳性也被证明与甲状腺癌的临床病理特征相关。由MSI在甲状腺癌中的表达，与甲状腺癌发生、预后和临床病例特征的密切联系可看出，与甲状腺癌相关的MSI研究应重视THRA1、D2S123两个位点，进而进行有目的的基因治疗，达到抗肿瘤的目的。本研究中LOH 在THRA1、D2S123、BAT26、D18S58的检出率分别为33.3%，26.7%，23.3% 和 16.7%。这些位点存在LOH，提示各自的肿瘤抑制基因起到了相应的作用。有研究提示 2号、18号染色体LOH在甲状腺癌的发生过程中起重要作用，提示相应染色体存在抑癌基因〔17〕。根据Knudson的“二次打击”学说，癌的发生需要抑癌基因的一对等位基因均发生改变，所以甲状腺癌特异性抑癌基因若有一个等位基因发生改变，则该个体就是甲状腺癌的易感个体。如果在甲状腺癌标本的某一染色体位点检测出频发的基因改变，则此位点附近可能存在抑癌基因。深入分析2P、18q位点DNA分子结构与甲状腺癌的关系，对于明确甲状腺癌发生分子机制，绘制甲状腺癌基因异常“图谱”具有重要意义。

　　3.5 MSI、LOH与甲状腺癌临床病理、生理参数及预后的关系 本研究显示，D2S123位点MSI与滤泡型甲状腺癌有明显相关性;D18S58位点MSI的阳性率与高龄患者、晚期肿瘤密切相关。对所选患者随访5年，发现MSI/LOH阳性的甲状腺癌较阴性者生存期更长，并具有统计学意义。Stoler〔17〕的研究表明，MSI在恶性甲状腺癌中的阳性率为70%，良性肿瘤中为65.4%，MSI与甲状腺肿瘤病理类型相关;Minal等〔16〕认为晚期甲状腺癌MSI阳性率高于早期癌，与本研究结果一致。Stoler、Minal和本研究采用不同的基因位点研究MSI/LOH结果相似，认为MSI/LOH导致基因组不稳定，在甲状腺肿瘤发生的早期发挥作用，是甲状腺癌发生过程中的一个早期分子事件，并贯穿于甲状腺癌发生发展的全过程，并参与甲状腺癌细胞的分化和侵袭过程，与甲状腺癌预后相关。但MSI/LOH在预后评估方面的确切意义尚需进一步扩大检测样本和临床随访来证实。

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