喉癌淋巴结转移相关分子标志物的研究进展

　　作者：刘跃华,梁丹,黎万荣　　作者单位：泸州医学院附属医院耳鼻咽喉—头颈外科，四川 泸州 646000

　　【摘要】喉癌是耳鼻咽喉—头颈外科的常见恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤中发病率较高，占耳鼻咽喉恶性肿瘤的11.6%-22%，占全身肿瘤的2%，复发和转移是导致喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴结转移是喉癌转移的早期事件和独立的预后因素。喉癌淋巴结转移过程可能涉及到许多分子作用机制和信号传导途径，包括肿瘤淋巴管生成相关基因、细胞粘附分子、细胞外基因相关蛋白、细胞因子、肿瘤转移相关基因等。本文综述喉癌淋巴结转移的相关分子标志物的研究进展。

　　【关键词】 喉肿瘤,淋巴转移,分子标志物

　　喉癌是耳鼻咽喉—头颈外科中发现率较高的恶性肿瘤，且发病率目前有明显增长趋势。复发和转移是导致喉癌死亡率居高不下的主要原因。淋巴结转移是喉癌转移的早期事件和独立的预后因素，因此预测和诊断喉癌淋巴结转移对病人的预后和治疗具有十分重要的意义，随着分子生物学的发展，尤其是基因芯片等技术的应用，已探索了许多与喉癌淋巴结转移相关的分子标志物，现综述如下。

　　1 肿瘤淋巴管生成相关因子

　　血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是第一个被发现的淋巴管生成因子，主要作用在淋巴管，具有很高的选择性，它可以诱导淋巴内皮细胞增殖、迁徙、并形成淋巴窦。大量的研究表明VEGF-C具有特异的促淋巴管生成的作用，其机制为与其受体VEGFR一3的特异结合，启动酪氨酸激酶信号系统促进淋巴内皮的有丝分裂。还可能通过增加淋巴管数量和大小，导致淋巴管扩张，影响肿瘤细胞浸润。在小鼠肿瘤模型上观察到VEGF-C的过表达可诱导肿瘤淋巴管生长，证实了淋巴管是肿瘤细胞转移播散到局部淋巴结的主要通路[1]。长期以来人们研究的重点一直放在血管与肿瘤增殖、转移的关系上，随着对淋巴管生成因子VEGF-C及其受体VEGFR-3和其他淋巴管特异标志物(如podoplanin,LYVE-1,Prox-1等)的发现肿瘤淋巴管生成的调控机制以及肿瘤淋巴转移机制已成为肿瘤研究的一个热点。

　　2 细胞粘附相关蛋白

　　2.1 分化抗原群44(Cluster of Differentiation 44,CD44) CD44属于黏附分子，人类CD44基因是一种高度保守的单拷贝基因，位于第11号染色体短臂上(11p13)包括标准型(CD44s)和变异型(CD44v)在淋巴细胞发育，归巢，肿瘤转移,细胞激活信号传导中发挥重要作用。CD44与喉癌侵袭，转移关系的研究报道总结如下：(1)CD44表达阳性的肿瘤细胞易于从癌巢向周围基质脱落，同时这种细胞又与细胞外基质中的透明质酸结合，获得黏附性，进而向周围正常组织呈多向性浸润生长，形成放散性癌巢。(2)CD44表达与喉癌淋巴结转移正相关与喉癌临床分期和组织病理学分级无明显关系[2]。

　　2.2 骨桥蛋白 (osteopontin,OPN)

　　骨桥蛋白(OPN)是一种具有多种生物学功能的分泌性，糖基化的磷酸蛋白，它有一个N端信号序列及Gly-Arg-Gly-Asp-Ser细胞黏附序列，并含有多个功能结合区，如钙结合域，凝血酶裂解位点及整合素的精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)结合序列，在细胞的黏附迁移，信号转导及组织修复中具有重要作用。OPN主要通过与其受体-整合素和CD44结合后发挥作用，并启动许多信号传导系统在肿瘤转移的各个环节起着重要作用：(1)OPN通过激活c-Src/EGFR/ERK信号转导通路诱导整合素ανβ3受体介导AP-I活化及uPA分泌[3]。(2)OPN通过PI-3K/Akt/IKK信号传导通路诱导NF-kB激活，上调uPAmRNA[4]。(3)OPN与ανβ3结合激活内皮细胞NF-κB通路，并激活Src和Ras,最终激活Ras-MAPK信号途径，调节细胞迁移等功能[5]。(4)OPN通过激活IκBα/IKK信号通路从而激活NF-κB，最终激活Pro-MMP-2[6]。Denhardt[7]报道，OPN转录活性的增强与细胞转移潜能的增加有关，肿瘤细胞或正常细胞产生的OPN均可刺激细胞的转移能力。随着肿瘤研究的深入，人们发现OPN在肝癌，肺癌，乳腺癌及头颈肿瘤等原发肿瘤及其转移肿瘤组织中高表达提示OPN可能与肿瘤的侵袭转移密切相关[8]。

　　3 细胞外基质相关的蛋白酶

　　3.1 尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminog activator，uPA)系统 uPA系列包括uPA、uPA前体(pro-urokinase type plasminogen activator，prouPA)、uPA受体(urokinase type plasminogen activator receptor，uPAR)及uPA 抑制因子(urokinase type plasminogen activator inhibitor，uPAI)等。它们的主要作用是参与纤溶酶原的激活和细胞外基质的降解，是介导肿瘤侵袭转移的主要酶系之一。uPA 系统是细胞外环境中最活跃的蛋白水解酶系统之一，uPA本身不仅具有降解细胞外基质的能力，而且与uPAR结合后激活纤溶酶原系统，继而引发更强烈、更广泛的蛋白水解活动。uPA与uPAR相结合，不仅将纤溶活动局限并强烈地集中在肿瘤细胞表面，而且通过uPAR经细胞内吞后的再次释放从时间和空间上协助肿瘤细胞完成所谓的肿瘤细胞调控的组织重建。另外，uPA通过与uPAR相结合调节细胞内的一系列信号转录以促进肿瘤的侵袭和转移 。大量的研究表明，恶性肿瘤组织的uPA 和uPAR的表达高于正常组织，而且，高水平表达的uPA和uPAR与不良预后相关。在喉癌中uPA、uPAR的表达水平呈现不均一性，其表达水平与肿瘤大小、T分期、病理分级无关，与临床分期、颈淋巴结状况有明显的相关性：即高水平表达者，其临床分期晚、易发生颈淋巴结转移，高水平表达uPA、uPAR的癌细胞降解细胞外基质和基底膜的能力增强，使这一部分细胞更易向深层组织和淋巴管浸润，形成转移。

　　3.2 乙酰肝素酶 (heparanase，HPA)

　　乙酰肝素酶是新近克隆成功的酶，裂解连接于HSPGs核心分子上硫酸肝素的一类内切糖苷酶，是抗肿瘤的理想靶点[9]。乙酰肝素酶主要通过以下途径促进肿瘤细胞的侵袭和转移：(1)通过降解ECM 和BM促进肿瘤细胞的侵袭和转移;(2)通过使HSPG释放和活化肝素结合型bFGF诱导血管生成;(3)该酶对HSPG的降解产物可以抑制活化T淋巴细胞的生物学功能;(4)乙酰肝素酶促进释放尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物，二者使纤溶酶激活。纤溶酶除具有活化基质金属蛋白酶作用外，还具有促进HS结合型活性bFGF释放的功能;(5)乙酰肝素酶可能促进释放组织特异性生长因子，参与肿瘤细胞转移和器官组织特异性的选择。Beekhove等[10]通过研究头颈部鳞癌组织和细胞中乙酰肝素酶的表达情况，发现19个原发肿瘤中13个表达阳性，12个转移的淋巴结中9个表达阳性，乙酰肝素酶在转移淋巴结中的表达高于原发肿瘤组织的表达，提示乙酰肝素酶参与了头颈部癌的侵袭转移。

　　4 细胞因子

　　4.1 转化生长因子(transfonning growth factor，TGF)β TGF-β是调节细胞生长、分化的多功能细胞因子家族.TGF-β1 在肿瘤细胞迁移、细胞外基质形成、肿瘤血管形成等方面发挥重要作用。目前研究发现，TGF-β1 在肿瘤的发生、发展中起着双向调节作用，即在癌变早期发挥生长抑制作用，而在癌进展期促进肿瘤的发生[11]。在早期TGF-β1通过诱导抑制性蛋白p15，p21，p27等的生成而抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)，使细胞停止在G1期从而发挥抑癌因子的作用;在肿瘤浸润转移过程中，肿瘤细胞和瘤内基质细胞产生大量TGF-β1，非但对肿瘤细胞无增殖抑制作用(即TGF耐受)，反而通过增加瘤细胞与胞外基质的相互作用、增加血管生成和引发肿瘤免疫逃逸现象等促进肿瘤浸润、转移。在对喉癌的研究中发现TGF-β1与喉癌浸润的程度、淋巴结转移等生物学行为有关。

　　4.2 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)

　　肝细胞生长因子是一种很强的刺激肝细胞增殖的丝裂原，与其单一受体c-Met结合后可调节细胞的分裂、增殖、分化、迁移等生物学行为[12]。现有的研究表明，HGF是一种多功能细胞因子，其作用不仅仅局限于肝细胞内，被HGF激活的c-Met可以导致Ras/MAPK和PI3-K/PKB等信号传递的级联激活从而刺激多种肿瘤细胞的增殖、分化以及浸润和转移，甚至能够诱发肿瘤性的血管形成，从而在人类肿瘤的发生和演进过程中起着十分重要的作用。有关HGF/c-Met系统在促进恶性肿瘤细胞浸润和转移方面的作用已屡有报道Yucel OT等[13]运用免疫组化法检测60例声门上型喉鳞状细胞癌标本中c-Met的表达情况，结果显示90%的病历存在着c-Met的过度表达，颈淋巴管浸润病历中有83%存在淋巴结转移，N期分类与淋巴结转移有关。

　　5 转移相关基因

　　5.1 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)

　　PTEN是1997年由美国Steck等3个研究小组分别发现并命名的一种新型的抑癌基因。其定位于10号染色体q23.3区，有9个外显子，编码1个含403个氨基酸的蛋白产物。在正常细胞中PTEN蛋白通过PI3K/PTEN/Akt信号转导途径发挥抑癌作用。PTEN蛋白可拮抗PI3K的作用，使其作用的底物去磷酸化，降低细胞内第二信使3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇的含量对PI3K/PTEN/PKB/AKt信号转导途径起负调控作用，使蛋白激酶 PI3K的活性维持在正常水平，从而调节细胞的物质代谢和凋亡。喉鳞状细胞癌中存在抑癌基因PTEN的缺失和突变，吴强等[14]发现在喉癌中PTEN蛋白阳性表达与病人性别、年龄、组织学分级、及临床分期无关而与颈淋巴结转移有关PTEN基因阴性表达的喉癌易发生颈淋巴结转移与Rubin[15]的研究发现PTEN基因异常与前列腺癌的淋巴结转移有关一致。

　　5.2 存活素基因(Survivin gene)

　　凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis,IAP)是一组凋亡抑制蛋白，目前认为其中某些成员可以抑制凋亡传导通路终末效应子caspase3和caspase7而发挥凋亡作用[16]。Survivin基因是新近发现的IAP家族成员之一，具有不同于LAP家族其它成员的独特性质和结构，在正常成人组织中不表达而选择性的表达于恶性肿瘤组织，这种独特的表达特性使其成为恶性肿瘤诊断与治疗的新点。Survivin表达可促进细胞表型的恶性转化，可能是某些恶性肿瘤发生的关键因素。sarela[17]认为，在恶性肿瘤中，脱落的癌细胞因为survivin对凋亡的抑制而受到了保护，得以继续存活并分裂增殖，进而形成肿瘤邻近或远离部位的转移，从而引起预后不良。目前研究Survivin表达与各临床病理参数关系得出Survivin基因在喉癌组织中高表达，转移组高于无转移组，复发组高于未复发组，且随着肿瘤分期的上升，Survivin阳性表达率也明显上升，5年内死亡组高于5年存活组，表明Survivin阳性表达与喉癌自然病程有关，可能影响喉癌的发生，发展，提示Survivin 的表达可以影响喉癌的生物学行为，可使其更易发生转移，复发等恶性行为，同时是预后不良的指征.Survivin作为IAP家族的成员之一，认为其可能是通过抑制正常细胞凋亡信号传导通路，使一些受损细胞逃避机体免疫系统的监视而无法消除，从而异常存活，累积形成优势克隆而参与肿瘤的发生，发展[18]。

　　5.3 周期素D1(Cyclin D1)

　　Cyclin D1是G1周期素家族最重要的成员，又称PRAD1、CCND1、BCL-1，为目前公认的癌基因[19]。Cyclin D1是细胞周期中G1/S转换的重要正调因子，与肿瘤的进展和预后密切相关。目前认为Cyclin D1作用机制与Rb蛋白密切相关，在正常细胞周期中，Cyclin D1与细胞周期依赖激酶4(cyclin dependent kinase，CDK4)形成复合物Cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，由此解除了Rb这种抑癌基因调控G1 期停滞的作用，使Rb失去抑制转录因子E2F启动DNA合成的功能，使细胞周期从G1期进入S期，完成细胞增殖。其过度表达和错误调控均可导致细胞周期调控异常，从而发生肿瘤。研究表明[20]Cyclin D1在正常组织中表达量很少甚至不表达，而在乳腺癌、前列腺癌及头颈部鳞癌等许多恶性肿瘤中存在蛋白质的过度表达，是预示肿瘤进展及患者预后的重要指标之一。国内外大量研究证实喉癌组织中cyclin D1阳性表达率与肿瘤的病理分化程度、颈淋巴结转移及预后有关即喉癌伴淋巴结转移者cyclin D1阳性表达率高于无淋巴结转移者，Cyclin D1表达上调与与喉癌恶性程度，颈淋巴结转移及预后密切相关，Cyclin D1表达增加对颈淋巴结转移发挥重要作用。

　　6 展 望

　　尽管喉癌侵袭转移的分子机制极其复杂，但随着各种新技术，尤其是基因组技术、生物芯片技术的不断改进，喉癌淋巴管生成和淋巴转移的机制将逐步明确。人们可以找到特异性的早期预测和诊断喉癌淋巴转移的分子标志物，使术前预测和诊断喉癌淋巴结转移成为可能，同时也可以针对特异的基因和分子作为治疗靶点，为喉癌的诊断和治疗开辟一条新途径。

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