S100A2在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义

　　作者：祝琳　　作者单位：泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，四川 泸州 646000

　　【摘要】目的研究S100A2蛋白在喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,lscc)中蛋白表达的情况，探讨其在喉鳞癌发生、发展、浸润转移中的作用。方法 收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年1月至2007年5月手术切除经病理诊断证实为喉鳞癌(LSCC)患者病理组织石蜡标本作为实验组，另取40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉粘膜组织标本作为对照组。所有石蜡标本按4μm连续切片2张,其中1张HE染色,另外1张用免疫组织化学染色SP法检测S100A2蛋白的表达。以试剂盒内阳性切片作为阳性组，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS)代替一抗做阴性对照。具体实验步骤参照试剂盒说明，显微镜下观察喉鳞癌组织及无肿瘤浸润的癌旁粘膜组织各组细胞中S100A2的分布情况并计数其阳性表达率。结果 喉鳞癌及正常喉粘膜组织中S100A2蛋白表达位于胞核和胞浆，呈黄色至棕黄色着色。40例无肿瘤浸润的癌旁喉粘膜组织中S100A2蛋白全部为阳性表达，表达率为100%(40/40)，40例喉癌组织中S100A2蛋白表达率为78%(31/40)，阳性表达低于无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜(P<0.05);S100A2蛋白在不同分化程度喉鳞癌中的阳性表达率为：高分化组表达阳性率为91%，中分化组表达阳性率为90%，低分化组表达阳性率为25%。而高、中分化组间无明显差异(P=0.876)，高、中分化组高于低分化组(P<0.05)，表明S100A2蛋白表达率不同于喉鳞癌分化程度;在无颈淋巴结转移的喉鳞癌组织中S100A2蛋白阳性率为88%，表达率高于有颈淋巴结转移的喉鳞癌组织阳性表达率54.5%(P<0.05);TNM分期，T1～T2期中S100A2蛋白的表达阳性率为78.6%，T3～T4期中S100A2蛋白的表达阳性率为76.9%，两者比较，无明显差异(P=0.905);不同年龄组患者喉鳞癌组织中，60岁以上组S100A2蛋白阳性表达率为78.6%，60岁和60岁以下组S100A2蛋白阳性表达率为75.0%，两者差异水平不显著(P=0.804)。结论 (1)S100A2蛋白基因在喉鳞癌中存在表达缺失或下调，与喉鳞癌分化程度、淋巴结转移有关，与TNM分期及患者年龄无关，推测其在喉鳞癌的发生发展及浸润转移中起重要作用。(2)S100A2在喉鳞癌中为抑癌基因，对S100A2蛋白表达的检测，可能成为判断喉鳞癌细胞生物学行为的参考指标之一。

　　【关键词】 S100A2,喉鳞癌,免疫组织化学方法,头颈外科

　　ABSTRACT Objective To study the expression of S100A2 protein in the laryngeal squamous cell cancer (LSCC) and to discuss its potential role in the occurrence, development and metastasis of laryngeal squamous cell cancer. Methods The pathological tissues from 40 cases with LSCC confirmed by operation and pathological study were selected as the test group while the mucosal tissue samples adjacent to cancer location from 40 cases without cancer infiltration confirmed by operation and pathological study were gathered as the control group; 2 serial sections of 4μm thickness were got from all the paraffin tissues, one dyed with HE and the other with immuno-histochemic method; SP method was applied to detect the expression of S100A2 protein. The positive sections in the kit were used as positive control and Phosphate Buffer Solution (PBS) as negative control; the actual experimental steps just followed the instruction of the kit; microscope observation was made to the distribution of S100A2 protein expression in the tissue cells of LSCC and in the mucosal tissue cells adjacent to cancer location without cancer infiltration, and the rates of positive expression were recorded. Results The expressions of S100A2 in the tissues of LSCC and in normal laryngeal mucosal tissue were mainly located in the nucleus and cytoplasm in yellow or yellow-brown color; the S100A2 protein expressions in laryngeal mucosal tissues from the 40 cases with no cancer infiltration were all positive and expression rate was 100% (40/40) while the expression rate in LSCC tissues was 78% (31/40), the positive expression was lower than that of the mucosal tissue cells adjacent to cancer location (P<0.05); the positive expression rate of S100A2 protein in LSCC of different differentiations ranged as follows: the positive expression rate in good differentiation was 91%, 90% in moderate differentiation and 25% in poor differentiation; there was no obvious difference between good differentiation and moderate differentiation (P=0.876) but their rates were higher than that in poor differentiation (P<0.05), which indicated that the expression rate of S100A2 protein was different from the differentiation of LSCC; the positive rate of S100A2 protein in the tissues of LSCC with no cervical lymph node metastasis was 88%, it was higher than that of 54.5% in the tissues of LSCC with cervical lymph node metastasis (P<0.05); the positive expression rate of S100A2 protein in T1～T2 classification was 78.6% and 76.9% in T3～T4 classification, there existed no obvious difference (P=0.905); the positive expression rate of S100A2 protein in patients aged over 60 was 78.6% and 75.0% in patients aged 60 or below, the difference was not obvious (P=0.804). Conclusions 1. S100A2 protein has expression deletion in LSCC and is related to differentiation and lymph node metastasis but is not related to the classification and the age of patients, it can be inferred that S100A2 protein plays an important role in the incidence, development and infiltrative metastasis of LSCC; 2. S100A2 protein is a kind of cancer inhabiting gene, the detection of S100A2 protein expression may be one of the reference index for the judgment of biological behavior of the cells of LSCC.

　　KEYWORDS S100A2 laryngeal squamous cell cancer immuno-histochemic method

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料与仪器

　　1.1.1 资料 收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年1月至2007年5月行手术切除后经病理学诊断为喉鳞状细胞癌(lscc)的存档蜡块。所有病例术前均行喉部高分辨率CT检查，均未行放化疗治疗。40例喉鳞癌中，男性39例，女性1例,年龄45～71岁，平均61.8岁;病程2～36个月。将病例按年龄、不同分化程度、有无颈淋巴结转移、TNM分期进行分组。年龄以60岁为界，分为两组;按组织病理学分级分为高分化鳞癌22例，中分化鳞癌10例，低分化鳞癌8例;有淋巴结转移22例，无颈淋巴结转移18例;按1997年国际抗癌协会(UICC)制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;将40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜标本作为对照组。

　　1.1.2 主要实验试剂 兔抗人多克隆S100A2抗体(购于sigma公司)，SP免疫组化试剂盒、DAB显色盒购于(北京中杉生物技术有限公司)。

　　1.1.3 主要实验仪器 轮转式切片机(Leica-RM2035 产于德国)，OLYMPUS显微镜(BX-50，日本)，CS2002-1恒温干燥箱孵育盒 (重庆四达实验仪器厂)，SAYYO低温冰箱-20℃(MDF-330.产于日本)，病理图像分析处理系统(GD-8,中国)。

　　1.2 实验方法 所有样本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4μm。免疫组化染色按试剂盒说明进行，组织切片经脱蜡、水化、微波处理，进行抗原修复，阻断内过氧化物酶30 min ，PBS 冲洗3 次，每次3min，非特异性血清封闭30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水，透明，封片，镜检及摄像。采用预实验反复多次证实均呈阳性的组织切片为阳性对照，空白对照以PBS代替一抗。

　　1.3 结果判断及资料整理 S100A2阳性结果判定：细胞核或核与胞浆染成黄色或棕黄色或弥漫的棕黄色为阳性细胞;每张切片选择典型部位，随意选5个不同高倍视野(400×)计数，以平均数做最后判定。根据阳性细胞数占视野中总细胞数比例进行判定：阳性细胞数≤10%为阴性结果，阳性细胞数≥ 11%，为阳性结果。切片均经2位病理医生盲法独立计数阅片,两者不一致时重新计数。最后根据免疫组化染色编号，对应的病理号及住院号整理检测结果。

　　1.4 统计学处理 所得实验数据通过SPSS14.0软件进行统计学分析，检验水准а=0.05。计数资料采用χ2检验对结果进行统计学处理，比较其差异，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　60例标本全部进入结果分析，S100A2蛋白经免疫组化染色后于细胞核或细胞核与细胞质，出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表现。

　　2.1 S100A2蛋白在喉鳞状细胞癌及癌旁喉部黏膜组织中的表达(见表1) S100A2蛋白于无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织中，其阳性率表达为100%，而在喉鳞状细胞癌组织中，有31例呈阳性表现，阳性率为78%，经χ2检验，S100A2蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达明显低于无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织，具有显著差异(χ2=10.141,P<0.05)。

　　2.2 S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌分化程度的关系(见表1) 40例喉鳞状细胞癌标本中，(1)高分化为22例，其S100A2蛋白表达阳性率为91%;(2)中分化为10例，其S100A2蛋白表达阳性率为90%;(3)低分化为8例，其S100A2蛋白表达阳性率为25%,经卡方检验，组间比较，高分化与中分化喉鳞状细胞癌中S100A2蛋白表达阳性率明显高于低分化组，差异显著((1)与(3)χ2=13.032, (1)与(3)χ2=7.901,P<0.01);而高分化与中分化组间阳性表达率比较差异不明显(P=0.876)。

　　2.3 S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌中淋巴结转移的关系(见表1) 40例喉鳞状细胞癌中，有淋巴结转移22例，其S100A2蛋白表达阳性率为54.5%;无淋巴结转移18例，其S100A2蛋白表达阳性率为88.9%，明显高于有淋巴结转移组，组间比较差异显著(χ2=5.389，P=0.020，P<0.05)。

　　2.4 S100A2蛋白表达与喉鳞状细胞癌临床TNM分期的关系(见表1) 按1997年国际抗癌协会(UICC)制定的恶性肿瘤分期标准，将喉鳞状细胞癌行TNM分期，40例标本中处于T1～T2期的14例，其中S100A2蛋白的表达阳性率为78.6%;处于T3～T4期的26例，其中阳性表达20例，阳性率为76.9%。经χ2检验，T1～T2期中S100A2蛋白的表达阳性率与T3～T4期比较，差异不明显(χ2=0.014，P=0.905)。

　　2.5 S100A2蛋白表达与患者年龄的关系(见表1) 将不同年龄组患者S100A2蛋白表达阳性率进行统计学分析。40名患者中≤60岁的12例，其中S100A2蛋白阳性表达者9例，阳性率75.0%;>60岁的28例，S100A2蛋白阳性表达者22例，阳性率78.6%，两组比较无明显差异(χ2=0.061，P=0.804)。说明年龄不是影响喉鳞癌中S100A2蛋白表达水平的因素。

　　表1 喉鳞状细胞癌组织中S100A2蛋白表达与各临床因素的关系(略)

　　注：与无肿瘤浸润的癌旁喉部黏膜组织比较aP<0.05 ，与低分化喉鳞状细胞癌中S100A2蛋白表达阳性率比较：bP<0.05; 与中分化喉鳞状细胞癌中S100A2蛋白表达阳性率比较cP>0.05;与无淋巴结转移组比较dP<0.05;与T1～T2期组比较eP>0.05;与≤60岁年龄组比较fP>0.05

　　3 讨论

　　3.1 S100A2的结构及在肿瘤发生、发展和转移中的作用 Lee 等[1]利用消减杂交技术经正常细胞和肿瘤细胞(21MT-2，从胸膜渗出液中分离出的非整倍体细胞)的cDNA 和mRNA 经二轮杂交后，筛选并鉴定了S100A2 基因全长cDNA，S100A2定位于人染色体的1q21 的250 ～300kb 之间，全长为8670bp。此蛋白由两个EF-手型结构组成与钙离子有较高的亲和性，为S100钙结合蛋白家族的成员。综合国内外研究报道：S100A2在肿瘤发生、发展和转移过程中的具体作用机制可能主要有以下几方面：(1)在各种哺乳动物自发或化学诱发的肿瘤组织中，钙离子含量明显增加[11]，相反钙结合蛋白S100A2 在肿瘤组织中表达水平降低或缺失(后述)这种现象提示在钙结合蛋白S100A2 存在时因其能够结合钙离子而使钙离子浓度降低，致使细胞增生活性得到控制，从而抑制肿瘤的生成。(2)参与细胞周期调控作用：有研究学者检测到在正常乳腺上皮细胞周期中，S100A2 mRNA 在早G1期表达增加2倍，S期开始时增加2.5 倍，同时，细胞周期蛋白cdc2、cyclin A 和cyclin B mRNA 在G2期表达增加，而在乳腺癌细胞中，虽然细胞周期蛋白表达异常增高，但S100A2 却表达下降甚至缺失[12]。(3)与p53相互作用，P53是涉及人类肿瘤较为广泛的肿瘤抑制基因，也是头颈部肿瘤中被确定最多的抑癌基因，在喉鳞癌中的突变率达69.69%。现研究证实，其结果不仅促进细胞的生长，而且影响基因组的稳定性，从而加快细胞恶变，野生型p53是最常见的抑癌基因之一，起着分子警察作用，监视细胞基因的完整性，可通过多种途径发挥抑癌作用。S100A2启动子区有一野生型p53结合位点，野生型户p53对S100A2表达发挥正调控作用，而突变型p53无此作用，故使S100A2表达下调[13];(4)但也有人认为S100A2表达下调与启动子区超甲基化相关:在肿瘤细胞中，S100A2启动子区结合了某个转录因子，使该区超甲基化，导致S100A2转录沉默[14]。

　　3.2 S100A2在喉鳞癌中的表达及其意义

　　3.2.1 S100A2在喉鳞癌和正常喉黏膜组之间的表达及其意义实验结果表明，喉鳞癌组中S100A2蛋白阳性表达率为78.0%，明显低于正常喉黏膜组中100%的阳性表达率(P<0.05)，表明在喉鳞状细胞癌中存在S100A2蛋白表达的明显下调。S100A2 基因作为S100家族中唯一的候选抑癌基因，在许多恶性肿瘤中表达明显降低，如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、表达水平低或缺失[5～9，15]。该实验结果与文献报道的S100A2在多种恶性肿瘤中表达明显降低的特征相符合。王秀清[15]等学者通过构建绿色荧光蛋白-S100A2融合基因表达载体，转染肝癌细胞，建立了S100A2基因治疗裸鼠模型，并通过细胞集落形成实验和裸鼠接种实验证实，外源性S100A2对肝癌细胞(QGY7701)集落形成有明显的抑制作用。因此，根据实验结果，我们推测，在众多的恶性肿瘤中，S1OOA2可能通过下调自身的表达，导致肿瘤细胞过度增殖、从而在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。

　　3.2.2 S100A2在喉鳞癌高、中、低分化组之间的表达及其意义实验结果显示，S100A2 蛋白在不同组织学类型喉鳞癌中表达率不同，高分化为22例，其S100A2蛋白表达阳性率为91%;中分化为10例，其S100A2蛋白表达阳性率为90%;低分化为8例，其S100A2蛋白表达阳性率为25%,经统计学分析，高、中分化喉鳞癌组S100A2 蛋白表达率差异无明显统计学意义(P>0.05);低分化喉鳞癌组S100A2 蛋白表达率明显低于高、中分化喉鳞癌组(P<0.05)，表明S100A2 蛋白的表达率降低与喉鳞癌分化程度有关。这一结果与S100A2蛋白的表达率与文献报道的胃癌、食管鳞癌[8]不同分化程度相关的实验结果及Kyriazanos[13]等发现S100A2与肿瘤的分化程度相关，分化程度越高，S100A2表达越高的观点相符合。据此，推测该基因在肿瘤细胞分化过程中可能起着重要的作用。

　　3.2.3 S100A2在喉鳞癌有无颈淋巴结转移中的表达 喉癌病人有无颈淋巴结的转移对其愈后有着重要的影响。颈淋巴结转移发生的时间与肿瘤的原发部位，肿瘤细胞的分化程度及病人对肿瘤的免疫力有者密切的关系。本实验进一步探讨了S100A2蛋白表达与喉鳞癌临床病理因素之间的关系，发现有淋巴结转移22例，其S100A2蛋白表达阳性率为54.5%;无淋巴结转移18例，其S100A2蛋白表达阳性率为88.9%。有颈淋巴结转移组S100A2蛋白表达阳性率明显低于无淋巴结转移组(P<0.05)，说明S100A2蛋白表达与喉鳞癌颈淋巴结转移有一定关系，这与Kyriazan检测到已发生淋巴结转移的肿瘤S100A2表达低于尚未发生淋巴结转移的肿瘤，以及国外学者提出的S100A2在头颈部鳞癌淋巴结转移中为下调蛋白的观点相一致[10]。考虑S100A2可能是通过抑制肿瘤的转移从而发挥抑癌作用，并与肿瘤的预后有关系，由此推测S100A2蛋白可能作为判断喉鳞癌生物学行为的重要参考指标。另外，也为S100A2对肿瘤抑制机制的研究提供新的思路。

　　3.2.4 S100A2在喉癌临床分期中及不同年龄喉鳞状细胞癌患者中的表达 喉癌患者发病年龄最多见于50～70岁，我们以60岁为界将40例喉鳞癌患者划分为两组，患者≤60岁的12例，其中S100A2蛋白阳性表达者9例，阳性率75.0%;>60岁的28例，S100A2蛋白阳性表达者22例，阳性率78.6%，对 S100A2蛋白表达阳性率进行统计学分析，结果为两组间无明显差异(P=0.804)。说明S100A2与患者的发病年龄无明显关系。根据1997年国际抗癌协会(UICC)制定的分期方案将40例喉鳞癌分为T1～T2期和T3～T4期两组，处于T1～T2期的14例，其中S100A2蛋白的表达阳性率为78.6%;处于T3～T4期的26例，其中阳性表达20例，阳性率为76.9%，T1～T2期中S100A2表达阳性率与T3～T4期相比没有明显差异(P=0.905)。这一结果与文献报道的S100A2在胃癌及食管鳞癌[8]中肿瘤浸润范围的表达特点相一致。考虑T分期受病程长短因素影响比较大，而此次比较S100A2是在不同病程的T分期中进行，故本次实验对S100A2在喉癌不同分期中肿瘤浸润范围的比较结果不甚确切，有待进一步探讨。

　　通过实验，我们了解到S1000A2可能为抑制喉鳞癌发生和转移的因子，根据其在喉癌中的表达特征，我们推测通过PTPCR和DNA重组技术及载体基因转移技术[15]使其在喉鳞癌中表达，可能成为有效治疗喉鳞癌的新思路。

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