单细胞凝胶电泳技术检测大鼠脑缺血再灌注后DNA损伤及海风藤提取物的干预作用

　　作者：姚博 冯建利 滕继军 杜怡峰 作者单位：山东大学山东省立医院神经内科，山东 济南 250021

　　【摘要】 目的 用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测局灶性脑缺血再灌注(I/R)大鼠神经细胞DNA损伤及海风藤干预作用。方法 应用线栓法建立Wistar大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型, 单细胞凝胶实验技术分别观察假手术组、模型组、二甲基亚砜(DMSO)组、海风藤提取物治疗组缺血灶周神经细胞DNA损伤的变化。结果 与假手术组比较，模型组和DMSO组DNA损伤率6～72 h明显增加，但海风藤组DNA损伤率与其他组比较24、72 h有明显下降(P<0.01，P<0.05)。结论 海风藤可以减轻I/R后神经细胞DNA损伤，对缺血脑组织有保护作用。

　　【关键词】 脑缺血;DNA损伤;单细胞凝胶电泳;海风藤提取物

　　基金项目：山东省卫生厅科技发展项目(2001CA1CBB1)

　　Detection of DNA damage after focal cerebral ischemia-reperfusion and intervention of extraction from Piper kadsura Ohwi by single cell gel electrophoresis

　　YAO Bo, FENG Jian-Li, TENG Ji-Jun, et al.

　　Department of Neurology, Shandong Provincial Hospital of Shandong University, Jinan 250021, Shandong, China

　　【Abstract】 Objective To investigate DNA damage after focal cerebral ischemia-reperfusion and intervention of extraction from Piper kadsura Ohwi by single cell gel electrophoresis (SCGE). Methods The models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) and reperfusion were established to detect DNA damage of nerve cell in the cerebral tissue among sham operated, model, DMSO-treated (dimethyl sulfoxide) and extraction from Piper Kadsura Ohwi-treated groups.Results Comparing shame operated group, model and DMSO groups had the obvious increase in DNA dagamge rate during 6～72 h, but Piper Kadsura Ohwi group had significant decrease during 24～72 h(P<0.01， P<0.05)compared with the other groups. Conclusions Extraction from Piper kadsura Ohwi plays a significant role in protecting cerebral tissue through decreasing the DNA damage caused by ischemia-reperfusion.

　　【Key words】 Cerebral ischemia;DNA damage; Single cell gel electrophoresis (SCGE);Extraction from Piper kadsura Ohwi

　　现代生物学技术对海风藤成分分析发现，其提取物中所含海风藤能明显抑制缺血再灌注(I/R)期脑组织磷脂酶A2和自由基的生成、减少大鼠脑缺血半暗带区神经细胞DNA的损伤〔1，2〕。单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)又称为彗星试验(Comet assay)，现被广泛用于放射生物学、细胞凋亡、肿瘤细胞治疗评价等领域，来检测肝细胞，各种肿瘤细胞和淋巴细胞〔3〕，但目前用于检测神经细胞DNA的文献仍然不多，故该研究在建立局灶性脑I/R(focal cerebral ischemia and reperfusion, FCIR)损伤动物模型后,采用SCGE来检测I/R后神经细胞DNA损伤及海风藤提取物对其的干预作用，旨在探讨其对实验性缺血后脑保护的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　SPF级健康雄性Wistar大鼠120只〔由青岛市实验动物和动物实验中心提供，许可证号：SCXK(鲁) 20030010〕，体重240～280 g，随机分为假手术组，模型组, 二甲基亚砜(DMSO)干预组和海风藤提取物干预组。这4个组再根据再灌注时间的不同分为6、24和72 h组，其中每组均为10只大鼠。其中海风藤组于缺血前及缺血后每隔12 h腹腔注射海风藤注射液1次，每次100 g体重注射1 ml，DMSO组单纯注射DMSO，用法及剂量同上，模型组不注射药物。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　低熔点琼脂糖，正常熔点琼脂糖，TritonX-100， EDTA(购自Amresco公司)，Tris碱，DAPI(4′6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochl-oride)，DMSO(美国Sigma公司)，电泳仪：DYY-ⅢTB转移电泳仪(北京市六一仪器厂)。

　　1.3 MCAO 模型的建立

　　应用改良的Zea-Longa〔4〕法，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉动物(300 mg/kg)，颈部正中切口，结扎左侧颈外动脉远端，热凝其分支，颈总动脉及颈内动脉动置动脉夹，断开颈外动脉后插入远端涂有硅胶直径0.24～0.26 mm的强力渔线，深度为距颈总动脉分叉处(18±0.5)mm，缝合皮肤。90 min后拉渔线至颈外动脉残端。假手术组强力渔线仅插入9 mm，使其不致阻塞，其余步骤同缺血组。

　　1.4 神经功能评价

　　动物麻醉清醒后，参照Longa〔4〕法进行神经功能评价。0分，无神经损伤体征;1分，不能完全伸展对侧前爪;2分，向对侧转圈;3分，向对侧倾斜;4分，不能自发行走意识丧失。

　　1.5 SCGE

　　各I/R大鼠分别于相应的再灌注时间(6, 24, 72 h)处死，开颅取脑后，去除低位脑干和小脑，取左侧缺血灶周脑组织0.5 g，用机械研磨法制成单细胞悬液，浓度调至106/ml。制片参照Singh〔5〕1988年的方法，稍加改进。在60℃下将100 μl正常熔点琼脂糖在无Ca2+，无Mg2+的PBS液下浇注到磨砂载玻片上为第一层，盖上骨玻片(22 mm×50 mm)置于4℃中固化10 min。待琼脂固化后去盖玻片，然后在37℃下将68 μl低熔点琼脂糖与16 μl(约2 000个细胞)的受检液混合后，滴于上一层的正常熔点琼脂糖上成为第2层，加盖玻片，置于4℃中固化10 min，最后将80 μl低熔点琼脂糖滴于上述琼脂糖上作为第3层，再置于4℃中固化10 min。裂解和解旋步骤参照Lobieniec〔6〕等采用的方法。取下盖玻片，将载玻片浸于新配制的裂解液中(pH 10, 2.5 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Na2-EDTA,10 mmol/L Tris碱, 质量分数1%的肌氨酸钠，质量分数1%的TritonX-100，质量分数10%的DMSO，最后两种在配制前加入)，置于4℃中避光保存1 h后，从裂解液中取出载玻片，用PBS(磷酸缓冲液pH 7)冲洗3遍以洗去过多的盐，然后放入水平电泳槽中，加入新鲜配制的电泳缓冲液(pH 13，1 mmol/L Na2-EDTA，300 mmol/L NaOH)解旋1 h，整个过程需避光。调整电压为18 V，电流为130 mA，电泳30 min，使带负电核的DNA片段离开主核向阳极迁移，形成彗星样拖尾。取出载玻片，在pH 7.5，浓度为0.4 mol/L的Tris溶液中浸泡15 min，然后加浓度为0.5 μg/ml的DAPI染色。5 min后用蒸馏水清洗，在荧光显微镜下观察结果。

　　1.6 DNA损伤程度判断标准

　　根据彗星尾部DNA含量占细胞总DNA的百分比将DNA损伤程度分5级〔7〕：0级<5%，无损伤，细胞核完整;1级5%～20%，轻度损伤;2级21%～40%，中度损伤;3级41%～95%，中度损伤;4级>95%，重度损伤。每个样本读取100个细胞并计算DNA损伤率：DNA损伤率为1～4级受损细胞数占总细胞数的百分值。

　　1.7 统计学处理

　　数据用SPSS13.0进行ANOVA分析处理，两两之间经LSD进行显著性检验。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠神经功能的评价

　　MCAO组大鼠麻醉清醒后均出现左侧Honer征，右侧前肢不能伸展，走路向右侧转圈或向右侧倾倒，神经功能评分1～3分，肢体瘫痪症状以缺血90 min再灌注12～24 h最显著。

　　2.2 DNA损伤结果

　　与假手术组比较，6，24和72 h模型组和DMSO组DNA损伤率明显升高(P<0.01);与模型组相比，海风藤组DNA损伤率24和72 h则明显下降(P<0.01， P<0.05)，见表1和图1。表1 4组大鼠I/R后不同时间的DNA损伤率(略)

　　3 讨 论

　　在正常情况下，一些抗氧化剂，如，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶都有清除活性氧化产物的能力。I/R由于抗氧化剂的失活和大量消耗及自由基过量产生，使DNA发生氧化性损伤〔8〕。自由基(如OH和O2)可以直接与DNA分子反应导致DNA断裂，它不仅攻击嘌呤的C8、胞嘧啶的C5和C6的双烯键，导致DNA碱基置换和脱落，使DNA单链断裂，而且还可以通过Ca2+依赖的信号途径激活内源性的核酸内切酶〔9〕，该酶识别特定的碱基序列，水解核酸链中磷酸二酯酶，切割双链，从而产生DNA双链片段。SCGE是一种在细胞水平上检测DNA损伤和修复的方法，快速并且敏感。Huang等采用外切酶Ⅲ和Klenow片段检测方法，证实MCAO 90 min再灌注15 min，DNA碱基损伤增加，并认为这可能和自由基损伤有关〔9，10〕。细胞受损后细胞中的膜结构在裂解液中遭到破坏，然后蛋白质、RNA等都可以扩散到裂解液中，而核DNA分子量高仍留在原位;后在碱性环璄中解旋，释放出DNA断链和碱变性片段。因其分子量小且为单链，所以就可以离开核DNA在凝胶分子中向阳极移动，形成彗星状图像。通过测定DNA迁移的长度就可以确定其损伤程度：DNA受损越严重，在相同条件下迁移的DNA量就越多，距离就越长，DNA损伤率就越高〔11,12〕。本研究结果发现6～72 h 神经细胞DNA损伤率明显增加，与既往的研究相吻合〔13〕。

　　【参考文献】

　　1 王 伟，董为伟.海风藤对缺血鼠脑磷脂酶A2、三磷酸肌醇及自由基形成的影响〔J〕.中华神经科杂志，1996;29(6)：325-8.

　　2 郭瑞友，于义英，方思羽，等. 海风藤对局灶性脑缺血治疗作用的实验研究〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2003;1(8):461-3.

　　3 Hellman B, Friis L, Vaghef H, et al. Alkaline single cell gel electrophoresis and human biomonitoring for genotoxicity: a study on subjects with residential exposure to radon 〔J〕. Mutat Res,1999;442(2):121-32.

　　4 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

　　5 Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells〔J〕. Exp Cell Res,1988;175(1)：184-91.

　　6 Labieniec M, Gabryelak T. Measurement of DNA damage and protein oxidation after the incubation of B14 Chinese hamster cells with chosen polyphenols〔J〕. Toxico Lett，2005;155(1)：15-25.

　　7 赵 倩，段丽菊，刘英帅.彗星实验检测单细胞DNA损伤的方法〔J〕.公共卫生与预防医学，2004;15(5)：57-9.

　　8 姜招峰，周 翔，杨翰仪. 氧自由基对大鼠海马及皮层的损伤作用〔J〕.中国老年学杂志，2002;22(2)：158-60.

　　9 Giovannelli L, Cozzi A, Guarnieri I, et al. Comet assay as a novel approach for studying DNA damage in focal cerebral ischemia: differential effects of NMDA receptor antagonists and poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors〔J〕. J Cereb Blood Flow Metab，2002;22(6):697-704.

　　10 Huang D, Shenoy A, Cui J, et al. In situ detection of AP sites and DNA strand breaks boaring 3’-phosphate termini in ischemic mouse brain〔J〕. FASEB J,2000;14(2):407-17.

　　11 Topouzova-Hristova T, Daza P, Garcia-Herdugo G, et al. Volatile anaesthetic halothane causes DNA damage in A549 lung cells〔J〕. Toxicol In Vitro, 2006;20(5)：585-93.

　　12 Choucroun P, Gillet D, Dorange G, et al. Comet assay and early apoptosis〔J〕. Mutat Res, 2001;478(1-2)：89-96.

　　13 王 宁，薛荣亮，姚凤珍，等.c-Jun氨基末端激酶在全脑缺血再灌注大鼠海马神经元DNA修复中的作用〔J〕.中华麻醉学杂志，2007;27(12)：1110-3.