鼻咽癌患者中CD4+CD25+T细胞与CCR4的相关性

　　作者：隋军,任艳鑫,李晓江,宋鑫,马静　　作者单位：昆明医学院第三附属医院：1. 肿瘤生物免疫治疗中心;2. 头颈外科，云南昆明

　　【摘要】 目的 探讨鼻咽癌患者全身及肿瘤局部的免疫状态及其与CC类趋化因子受体4(CCR4)的关系。方法 采用流式细胞术检测初诊鼻咽癌患者组织(25例)及外周血(35例)中CD4+CD25+T细胞与CCR4阳性细胞在淋巴细胞中的比例，并进行统计学分析。结果 鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+T细胞及CCR4阳性细胞的比例高于对照组(P<0.05);两种细胞在鼻咽癌组织中的比例高于外周血(P<0.05)，而对照组外周血与组织中却无明显差别(P>0.05);鼻咽癌Ⅲ+Ⅳ期组织中的 CD4+CD25+T细胞比例高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，外周血中两组无明显差别(P>0.05);鼻咽癌组织及外周血中的CD4+CD25+T细胞与CCR4阳性细胞存在正相关关系。结论 鼻咽癌患者存在不同程度的免疫抑制，肿瘤局部免疫抑制更为严重;CD4+CD25+T细胞的比例与鼻咽癌分期相关，分期越晚，该细胞比例越高;CCR4在介导CD4+CD25+T 细胞趋化到肿瘤局部的过程中起了一定作用。

　　【关键词】 鼻咽癌,CD4+CD25+T细胞,CC类趋化因子受体4,流式细胞术

　　ABSTRACT: Objective To explore the immune function of the whole body and the tumor site of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) patients as well as its correlation with CCR4. Methods The ratios of CD4+CD25+T cells and CCR4+cells to lymphocytes were measured by flow cytometry in tissues (25 cases) and peripheral blood (35 cases) from nasopharyngeal carcinoma patients, and then statistical analysis was made. Results The ratios of CD4+CD25+T cells and CCR4+ cells in tissue and peripheral blood of NPC were higher than those in the control group (P<0.05). In NPC the ratios of the two cells in tissue were higher than in peripheral blood respectively (P<0.05), but there was no such difference between tissue and peripheral blood in the control group (P>0.05). The ratio of CD4+CD25+T cells in tissue at stage Ⅲ+Ⅳ was higher than that at stage Ⅰ+Ⅱ of NPC (P<0.05), but there was no such difference between the two stages in peripheral blood in NPC. There was a positive correlation between CD4+CD25+T cells and CCR4+ cells in tissue and peripheral blood of NPC (P<0.05). Conclusion NPC patients have different immunosuppression, and there is even more severe immunosuppression in the tumor site. The ratio of CD4+CD25+T cells is correlated with the stage of NPC. Therefore, as NPC progresses to later stages, the percentage of CD4+CD25+T cells is increased, which is correlated with poor prognosis. CCR4 plays an important role in reactant of CD4+CD25+T cells to tumor sites, and is resistant to immunosurveillance.

　　KEY WORDS: nasopharyngeal carcinoma (NPC); CD4+CD25+T cell; CC chemokine receptor 4( CCR4); flow cytometry (FCM)

　　恶性肿瘤患者全身和肿瘤局部的免疫系统都处于免疫耐受或免疫抑制状态。许多恶性肿瘤尤其是早期病例，在局部出现免疫抑制的状态下而全身免疫并无缺陷。CD4+CD25+T细胞作为一种免疫调节细胞，主要特点是降低普通T细胞对刺激的增生反应(无反应性)以及其强大的抑制能力。在肿瘤免疫中，CD4+CD25+T细胞通过细胞间直接接触或分泌细胞因子的方式，作用于抗原呈递细胞或效应T细胞发挥其免疫调节作用。本研究应用流式细胞术检测鼻咽癌患者肿瘤浸润淋巴细胞及外周血中CD4+CD25+T细胞的频数，探讨其对鼻咽癌患者免疫状态的影响，同时分析CC类趋化因子受体4(CCR4)在CD4+CD25+T细胞发挥免疫调节作用中所扮演的角色。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集2006年3月～2007年5月本院初诊鼻咽癌患者外周血标本共35例(男23例，女12例)，其中10例患者为院外取材确诊，故收集组织标本25例(男15例，女10例)。所有标本经病理证实为鼻咽癌，其中低分化鳞癌33例，中高分化鳞癌2例。患者院外均未接受任何治疗，排除既往有免疫系统疾病，未服用任何影响免疫系统的药物。患者年龄19～68岁，平均49.23岁;有淋巴结转移者32例，无淋巴结转移的3例。根据1997年UICC和AJCC联合提出的鼻咽癌TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期13例。正常对照组12例，均为患者自感不适，经本人及家属同意在我院行鼻咽部取材，病理检查排除鼻咽部肿瘤，其中2例示鼻咽部黏膜慢性炎症，余均为正常。其中男7例，女5例，年龄31～60岁，平均45.36岁。本实验的组织标本与病理标本均来源于同一次取出同一块标本上，同时为了避免对临床诊断的干扰，实验标本只占病理标本的一小部分(直径约5mm)，组织标本取出后置于液氮保存备用，血液标本每人取外周血2mL，肝素抗凝，所有标本取出之前均经患者同意。

　　1.2 实验试剂及仪器

　　CD4+CD25+T细胞用三色法(CD4 FITC/CD25PE/CD45PC5)，阴性对照为(IgG FITC/IgGPE/CD45PC5);CCR4采用双色法(CCR4PE/CD45PC5)，阴性对照为(IgGPE/CD45PC5)。EPICSXL型流式细胞。上述试剂及仪器均为BeckmanCoulter公司提供。

　　1.3 流式细胞术

　　鼻咽部组织处理：将组织剪碎，37℃消化2h(含1g/L胶原酶、25u/mL的透明质酸酶、0.1g/L DNase)，用300目筛网过滤后加三色荧光标记抗体10μL，阴性对照相同;摇匀、避光室温静置15～20min。外周血：取全血100μL，加三色荧光抗体10μL，阴性对照相同;避光室温静置20min，用Qprep 自动溶血，30min后上机检测。分析组织及外周血中CD4+CD25+T细胞亚群及CCR4的表达，CD45+细胞为淋巴细胞，分别计算CD4+CD25+T细胞在淋巴细胞中的比值以及CCR4+的淋巴细胞。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS11.5 统计软件包分析，数据用t检验及用pearson 系数表示两变量间的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+T细胞的比例及CCR4的表达

　　鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+T细胞的比例分别为(16.19±2.78)%、(5.43±0.32)%，分别高于正常对照组的(3.57±0.15)%、(3.24±1.04)%，经统计学分析，差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。同时，鼻咽癌组织中CD4+CD25+T细胞的比例高于外周血，差异亦具有统计学意义(P<0.05，图1)，而正常对照组的鼻咽部组织与外周血中该细胞的比例无统计学差异。

　　鼻咽癌组织及外周血淋巴细胞中表达CCR4细胞的比例分别为(47.09±5.77)%、(11.22±1.41)%，分别高于正常对照组的(2.6±0.02)%、(2.43±0.89)%，经统计学分析，差异具有统计学意义(P<0.05，图1);而且，鼻咽癌组织中淋巴细胞表达CCR4的比例高于外周血(P<0.05，图1)。正常对照组两者间比较无统计学差异。图2示其中1例鼻咽癌患者组织及外周血淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞的比例及CCR4的表达。

　　2.2 鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+T细胞的比例与临床分期的关系

　　根据1997年UICC和AJCC联合提出的鼻咽癌TNM分期，我们将35 例鼻咽癌患者分为早期组(Ⅰ+Ⅱ期)和中晚期组(Ⅲ+Ⅳ期)。早期组和中晚期组组织中CD4+CD25+T细胞比例分别为(12.70±1.76)%、(23.76±2.29)%，二者比较差异具有统计学意义(P<0.05，图3);早期组和中晚期组外周血中CD4+CD25+T细胞比例分别为(6.12±0.65)%、(5.07±1.02)%，二者相比差异无统计学意义(P>0.05，图3);鼻咽癌组织及外周血淋巴细胞中表达CCR4的细胞比例在不同期组间并无统计学差异。

　　2.3 鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+T细胞与CCR4表达的相关性

　　分别对鼻咽癌组织及外周血淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞与表达CCR4的细胞进行相关性分析，发现两变量均呈正相关关系(r=0.85、0.78，P<0.05，图4)，而正常对照组组织及外周血中两变量间无相关关系(P>0.05，图4)。

　　3 讨论

　　肿瘤微环境是近年来深入研究肿瘤局部淋巴细胞与肿瘤细胞相互作用而提出的新概念。早期研究主要集中于肿瘤外周血的免疫状态。大多数肿瘤患者只有到了中晚期其全身免疫功能才出现明显下降，而肿瘤局部在肿瘤早期就存在免疫抑制。这也是早期研究所忽视的因素[1]。从某种意义上说，肿瘤的发生是宿主本身所具有的强大抗肿瘤机制失败的结果。在局部抗肿瘤免疫中，肿瘤局部淋巴细胞起着重要的作用，它在患者体内处于机体免疫系统与肿瘤相互作用的最前沿，其组成和功能等在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的性质、强度和总体水平。体外实验证明，将肿瘤局部淋巴细胞进行体外培养，经致裂原刺激后仍可活化并杀伤肿瘤细胞，但在体内肿瘤局部浸润的淋巴细胞不活化是常见的，说明肿瘤局部微环境中存在某种抑制淋巴细胞使之不活化的因素[2]。CD4+CD25+T细胞作为一种免疫调节细胞，在肿瘤中主要发挥免疫抑制作用，通过抑制CD4+ 、CD8+ T细胞来促使肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视。

　　本研究发现,鼻咽癌组织及外周血中CD4+CD25+ T细胞都有不同程度的升高，并且组织局部升高更明显。说明鼻咽癌患者普遍存在免疫抑制现象，而且肿瘤局部抑制程度更严重。我们现有的临床检测主要集中于患者外周血相关免疫指标，但是这些指标并不能客观、全面反映患者的免疫状态，这对临床治疗极为不利[3]。目前研究发现，卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等多种肿瘤患者的外周血和肿瘤局部CD4+CD25+T细胞成分增加[48]，其主要通过细胞间相互接触或分泌白介素10(IL10) 、转化生长因子β(TGFβ)来发挥免疫抑制作用。鼻咽癌组织中CD4+CD25+T细胞Ⅲ+Ⅳ期组高于Ⅰ+Ⅱ期组，而在外周血中两组间无统计学差异，这与相关报道一致[9]。提示鼻咽癌局部CD4+CD25+T细胞介导的免疫抑制与肿瘤进展密切相关[10]，可能是CD4+CD25+T细胞参与肿瘤细胞的免疫逃逸过程，从而促进肿瘤的生长。但是在外周血中我们并未看到此种趋势。外周血并不是机体抗肿瘤的第一现场，其CD4+CD25+T细胞的比例不能直接反映肿瘤局部的免疫状态。因此仅仅检测外周血CD4+CD25+T细胞的比例来评估鼻咽癌患者免疫状态是不够的。

　　同时，本研究发现，CCR4在鼻咽癌组织及外周血淋巴细胞中高表达，并且与CD4+CD25+T细胞呈正相关。肿瘤可以分泌多种趋化因子，与趋化因子受体相互作用，致使相关细胞游走到肿瘤局部发挥作用。但这是一个多步骤、复杂的过程，至今并未研究清楚[11]。目前研究发现，CCR4高表达于CD4+CD25+T细胞[12]，胃癌[13]、卵巢癌[14] 、霍奇金淋巴瘤[15]等肿瘤细胞可以分泌CCR4的配体CCL22，并且配体水平的高低与疾病的预后密切相关。因此，有研究者认为恶性肿瘤早期，效应T细胞识别肿瘤抗原并通过ADCC作用抑制肿瘤的生长，而肿瘤为了生存通过分泌趋化因子(CCL22、CCL17等)与CD4+CD25+T细胞表面的CCR4相互作用，诱导CD4+CD25+T细胞增殖并游走到肿瘤局部抑制效应T细胞，以逃脱机体的免疫。

　　在目前存在的免疫相关指标的基础上，CD4+CD25+T细胞可作为评估鼻咽癌患者免疫功能的一项新指标。CD4+CD25+T细胞与鼻咽癌的免疫抑制密切相关，通过去除或抑制CD4+CD25+T细胞将成为提高鼻咽癌患者免疫功能的有效治疗方法。本实验还发现CCR4在协助CD4+CD25+T细胞趋化到鼻咽癌局部过程中起了非常重要的作用，利用CCR4特异性抗体抑制这一过程也将成为免疫治疗的新途径。

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