急性脑梗死后内源性GCSF和CD34+细胞动员关系的研究

　　作者：陈小江 许志恩 陈倍楚 作者单位：广东医学院附属医院神经内科,广东 湛江 524001

　　【摘要】 目的 研究急性脑梗死患者发病后自身干细胞(外周血CD34+细胞)及其相关的粒细胞集落刺激因子(GCSF)水平变化。方法 采用对照研究，用流式细胞仪检测健康对照组和急性脑梗死组发病后第1天和第7天中造血干细胞(外周血CD34+细胞)，同时用ELISA法检测内源性GCSF的水平变化。结果 急性脑梗死后的第1天和第7天，患者体内外周血CD34+细胞和内源性GCSF的水平有不同程度的升高，并且患者中外周血CD34+细胞与血清内源性GCSF水平升高存在正相关(r=0.320)。结论 急性脑梗死早期，患者体内外周血CD34+细胞水平和内源性GCSF水平均升高，并且存在正相关。

　　【关键词】 急性脑梗死;造血干细胞;CD34+细胞;粒细胞集落刺激因子(GCSF)

　　基金项目：广东湛江市科技攻关项目(No.2006C03014)

　　The relationship between endogenous GCSF and CD34+ cell mobilization after acute cerebral infarction

　　CHEN XiaoJiang, XU ZhiEn, CHEN BeiChu.

　　Department of Neurology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To probe into the changes of serum hematopoietic stem cell and 　endogenous GCSF levels and there relationship in the patient of the acute cerebral infarction (ACI). Methods By a casecontrol method, the percentage of circulating hematopoietic stem/the CD34+ cells in leukocyte fractions were determined by FACS, the endogenous GCSF was detected by ELISA between the health individual controls and ACI group. Results The CD34+ cells in leukocyte fractions and endogenous GCSF in ACI group increased at different degree at the 1st and 7th day after ACI, presenting positive rectilinear correlation (r=0.320). Conclusions The CD34+ cells in leukocyte fractions and endogenous GCSF in the early after ACI increase, having positive rectilinear correlation.

　　【Key words】 Acute cerebral infarction; Hematopoietic stem cell (HSC); CD34+ cell; Granulocyte colony stimulating factor (GCSF)

　　近年来，急性脑梗死标志物的研究越来越深入，造血干细胞(HSC)和粒细胞集落刺激因子(GCSF)就是其中的两个指标。GCSF是体内一种重要的造血调节因子，具有动员造血干细胞、骨髓基质干细胞、内皮细胞的能力。目前，心血管研究领域中，已有学者发现急性心肌梗死的患者中外周血干细胞及血清GCSF的浓度升高，并且两者呈正相关〔1〕。国内外文献均有单独对急性脑梗死患者外周血干细胞〔2〕以及内源性GCSF血清浓度〔3〕的研究，但是未见GCSF与外周血干细胞之间有直接关系的报道。本文着重研究急性脑梗死早期机体对两者的动员作用和关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 急性脑梗死组39例，男22例，女17例，平均(65.17±10.83)岁，发病2 d内，临床分型(OCSP)为部分前循环梗死(PACI)和后循环梗死(POCI)，均为2006年6月～2007年11月于我院住院的首次发病患者，符合全国第四届脑血管疾病会议修订的诊断标准;并经头颅CT或MRI证实。病前未用过药物，3个月内无发热、脑血管意外、创伤及外科手术史。排除标准：各种感染及感染性疾病，严重肝、肾及免疫性疾病，肿瘤，血液病。对照组29例，男16例，女13例，平均(58.26±9.32)岁，为我院门诊健康体检者，无心、脑、肝、甲状腺疾病病史，无糖尿病病史，近期无炎症。把健康对照组29例设为第1组，纳入标准排除了已知可以影响内源性GCSF水平和外周血CD34+细胞的疾病;脑梗死后第1天患者设为第2组;脑梗死后第7天患者设为第3组。所有受试者均为汉族人，祖籍广东雷州半岛，经t检验及χ2检验，健康对照组的年龄及性别构成与病例组比较无显著性差异(P>0.05)。

　　1.2 方法 EPICS XL流式细胞仪(美国);BioTek ELX800酶标仪(美国);科大创新股份有限公司高速低温离心机等。深圳晶美生物工程有限公司的鼠抗人CD34+/FITC标记抗体，鼠抗人CD34+/IgG标记抗体，人GCSF ELISA试剂盒，红细胞裂解液等。

　　用EDTA抗凝管收集血液标本，每次采集外周血2 ml，分装于两支肝素抗凝管中。取其中一管，在8 h内用流式细胞仪进行上机检测CD34+细胞。另一管，当天内进行低温离心(4℃)，3 000 r/min离心10 min，将分离的上清液分装，冻存于-20℃冰箱保存，并用ELISA方法检测GCSF的水平。检测具体步骤按深圳晶美生物工程有限公司人GCSF ELISA试剂盒和CD34+/FITC标记抗体试剂盒操作说明操作。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS13.0 统计软件包进行统计分析，各组计量资料均以x±s表示，计数资料用χ2检验，计量资料用t检验，各组组间外周血CD34+细胞和内源性GCSF水平采用方差分析，两者之间的关系采用Pearson相关分析。

　　2 结果

　　2.1 各组内源性GCSF水平和外周血CD34+细胞占单核细胞的比例 第1组和第2组的GCSF水平均数之差无统计学意义，第1组和第3组比较，第2组和第3组比较，GCSF水平均数之差有统计学意义;第1组和第2组，第1组和第3组，第2组和第3组的外周血CD34+细胞均数之差比较均有统计学意义(见表1～表3及图1～图3)。

　　表1 三组内源性GCSF水平和CD34+细胞占单核细胞的比例(略)

　　表2 三组内源性GCSF水平的两两比较(略)

　　表3 三组CD34+细胞占单核细胞的比例的两两比较(略)

　　图1 健康对照组某对照者CD34+细胞的流式检测图(略)

　　图2 部分患者急性脑梗死1 d后CD34+细胞的流式检测图(略)

　　图3 部分患者急性脑梗死7 d后CD34+细胞的流式检测图(略)

　　2.2 内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平的关系 健康对照组中血清内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平的Pearson相关分析系数为0.170(P>0.05)，不能认为两者存在相关性。急性脑梗死患者血清内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平Pearson相关分析系数为0.320(P=0.004)，认为两者的升高存在着正相关(图4)。

　　图4 急性脑梗死患者中血清内源性GCSF与外周血CD34+细胞水平的散点图(略)

　　3 讨论

　　脑血管病造成神经细胞的死亡至今都没有确实有效的治疗方法，如何促进梗死区内神经细胞再生，是促进患者神经系统各项功能改善乃至完全恢复的关键。目前在利用干细胞动员剂GCSF动员骨髓干细胞向神经细胞分化的研究令医学界感到振奋和期待。

　　3.1 急性脑梗死患者内源性GCSF水平和外周血CD34+细胞占单核细胞的比例 GCSF广泛存在于体内组织和血循环中，主要由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞和骨髓间质细胞产生，此外还可由多种转化或非转化的细胞产生。GCSF的生物学作用必须通过与效应细胞表面特异性受体(GCSFR)结合而产生。每个中性粒细胞表面含有大量的GCSFR。通常随着中性粒细胞成熟水平的提高其受体的数量逐渐增加。成熟中性粒细胞的受体数量比原始粒细胞及晚幼粒细胞高2～3倍。但体外实验表明仅有极少量的受体与GCSF反应并最大程度地发挥其生物活性〔4〕。GCSF与GCSFR结合后，产生多种生物学效应，包括使干细胞增殖，并使外周血中性粒细胞增加;GCSF可以改变骨髓中造血干细胞表面的黏附分子，使造血干细胞突破骨髓屏障迁移到外周血中〔5〕，其结果是造血干细胞在体内进行了再分布，并释放于外周血。健康人群的内源性的GCSF水平并不高，且男女性别无差异，并且与白细胞和粒细胞计数无关。本研究中健康对照组GCSF水平为(44.34±12.24)pg/ml，略高于一些文献的均数值，但根据t检验，尚不能认为本研究中的GCSF水平高于正常，并且，年龄、性别构成在两组间无差异。

　　造血干细胞(HSC)是多潜能的干细胞，CD34+细胞是目前公认的造血干细胞的表面标记物。骨髓干细胞或动员的外周血干细胞能够归巢于受损器官的缺血组织,包括脑梗死的缺血区〔6〕，起到神经保护作用。在体外体内研究中,均已经证明了骨髓干细胞能够分化为神经细胞〔7〕。目前一些研究中已经认为：在动物模型中予以重组GCSF，能动员内源性干细胞，归巢至脑梗死部位，定向分化为神经细胞，同时，缺血边缘区的CD34+细胞的表达也增加，从而神经起到保护作用〔8〕。

　　在生理状态下，MSCs主要存在于骨髓中，外周循环中仅有少量MSCs，被称作循环干细胞(circulating stem cells，CSCs)，主要为CD34+细胞。而在病理情况下，机体可释放更多的MSCs到外周血循环中。尹小健等〔9〕通过动态观察急性脑梗死患者自体造血干细胞的水平变化及其神经损伤等因素间的关系，发现患者外周造血干细胞水平在2 w内呈逐渐升高的趋势，并推测脑梗死后造成的机体反应，使急性期外周血CD34+细胞增高。本研究结果与之相符，并且本研究进一步对脑梗死后内源性GCSF进行研究，结果显示：在脑梗死后第1天内源性GCSF的升高不明显，而外周血CD34+细胞的升高是明显的。推测在急性脑梗死中，存在着自身修复机制，能不断地动员GCSF和外周血CD34+细胞水平升高，而外周血CD34+细胞的升高并不完全依赖于内源性GCSF水平，还存在着未知的因素，尤其是脑梗死后启动的自我修复机制。

　　本研究中急性脑梗死后第7天内源性GCSF和外周血CD34+细胞均明显升高，并且两者有相关性，说明急性脑梗死后，机体对两者的动员作用是明显的。由于GCSF具有动员造血干细胞的作用〔10〕，在急性脑梗死早期反应性内源性GCSF的升高使到骨髓中的干细胞不断地释放入血，进一步增加外周血中CD34+细胞的数量。按照GCSF的药理学作用，动员CD34+细胞从骨髓释放至外周血是符合逻辑的。本研究表明，GCSF水平和外周血CD34+细胞水平有可能作为脑梗死的发生和预后的评估指标，可能对疾病的早期治疗和预后有提示作用。

　　急性脑梗死后，尤其在第7天后，血清GCSF水平和外周血CD34+细胞水平升高明显，与相应的受体结合，经复杂的分子间相互作用而介导其在骨髓内的识别与定位，黏附于骨髓血窦内皮开始,继之以稳定的黏附并穿行内皮细胞,最终达到血管外骨髓微环境并开始重建造血〔11〕，外周血CD34+细胞在一定条件下，很可能不断地向梗死受损的组织“归巢”，转化为特异的组织细胞〔12〕(在心肌梗死条件和特异微环境中转化为心肌细胞，在脑梗死条件和特异微环境中转化为神经细胞)，进而起到保护作用。根据GCSF的生物学作用，升高的GCSF能进一步增强CD34+细胞在脑梗死中起到的作用。

　　3.2 急性脑梗死后患者内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平的关系 健康对照组中血清内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平的相关系数很低，推测是由于在正常生理水平，内源性GCSF与外周血CD34+细胞水平和其他相关的各种细胞因子共同作用，维持在相对平衡的水平，故没有明显的线性相关。

　　在急性脑梗死发生后，由于一系列病理生理过程的改变，机体的急性反应，动员了内源性GCSF水平和外周血CD34+细胞水平，本研究认为：急性脑梗死后机体对两者的动员并不是同步的。由于GCSF本身也对造血干细胞具有动员的作用，因此两者的升高也具有相关性。在急性脑梗死后内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平存在着正相关(r=0.320，P<0.05)。但它们的相关系数不高，这种正相关还不是一种因果的相关。这与在急性心肌梗死后内源性GCSF水平与外周血CD34+细胞水平的相关性是一致的。

　　但是，急性脑梗死中自身动员升高的内源性GCSF数量十分有限，所以其动员的造血干细胞数量也十分有限，由此起到的神经保护作用也相当局限，因此仅凭急性脑梗死中自身动员的GCSF升高来增加造血干细胞数量是不现实的。这两个指标主要可用于急性脑梗死发生和预后的评估和警示。

　　【参考文献】

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　　8 Yanqing Z，Yumin L，Jian Q,et al.Fibronectin and neuroprotective effect of granulocyte colonystimulating factor in focal cerebral ischemia〔J〕. Brain Res，2006;1098(1):1619.

　　9 尹小健,赵 斌,邢永前.急性脑梗死患者自体外周血造血干细胞水平及其与神经损伤的关系〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(11)：12968.

　　10 Paczkowska E，Larysz B，Rzeuski R,et al.Human hematopoietic stem/progenitorenriched CD34+ cells are mobilized into peripheral blood during stress related to ischemic stroke or acute myocardial infarction〔J〕. Eur J Haematol，2005;75(6):4617.

　　11 Yong K，Fahey A，Reeve L,et al.Cord blood progenitor cells have greater transendothelial migratory activity and increased responses to SDF1 and MIP3 beta compared with mobilized adult progenitor cells〔J〕.Br J Haematol，1999;107(2)：4419.

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