脑梗死患者及健康者β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ多态性与血浆纤维蛋白原浓度比较及性别间差异分析

　　作者：朱莉 于凤秀 韩永涛 刘文君 周盛年 作者单位：山东大学齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012

　　【摘要】 目的 分析比较脑梗死(CI)及健康者β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ (βHaeⅢ)多态性和血浆纤维蛋白原浓度的性别间差异。方法 对102名发病10 d内的CI患者(男61例，女41例)和53名查体者(男35例，女18例)用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)的方法,分析受试者的基因型,用Follin酚法测定纤维蛋白原的浓度。结果 在CI患者和健康者中,βHaeⅢ多态性分布频率存在性别间差异。女性H1H2杂合基因型比例高于男性(P<0.05)，男性表现为H2H2纯合基因型(CI组比对照组为0.99比0.29) ,女性未发现H2H2基因型(P<0.05)。CI组男性血浆纤维蛋白原浓度较女性高〔(3.8±0.8)g/L vs (3.1±0.3)g/L,P<0.05〕。结论 无论是CI患者还是健康人群,βHaeⅢ多态性分布频率存在性别间差异。

　　【关键词】 脑梗死;性别;βHaeⅢ;多态现象(遗传学);纤维蛋白原

　　Comparison of β fibrinogen gene HaeⅢ polymorphisms and plasma fibrinogen in men and women with cerebral infarction patients and the healthy

　　ZHU Li, YU Feng-Xiu, HAN Yong-Tao,et al.

　　Department of Neurology, Affiliated Qilu Hospital of Medical College, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China

　　【Abstract】 Objective To compare the difference of β fibrinogen gene HaeⅢ polymorphisms and plasma fibrinogen levels between men and women with cerebral infarction (CI) and normal individuals.Methods The genotypes and fibrinogen levels of 102 CI patients (61 men,41 women) within 10 days after the event and fifty three controls (35 men,18 women) were determined by PCR and RFLP and Follin phenol method respectively.Results The difference of βHaeⅢ polymorphism′s frequency between men and women was significant.The frequency of H1H2 genotypes in female was higher than that of male(P<0.05). H2H2 genotypes were found in men (CI vs controls：0.99 vs 0.29). No H2H2 genotypes were discovered in women (P<0.05). Plasma fibrinogen levels in men were higher than those in women 〔CI: (3.8±0.8) g/L vs (3.1±0.3) g/L,P<0.05〕.Conclusions There is indeed difference in β fibrinogen HaeⅢ gene polymorphisms frequencies and plasma fibrinogen levels between men and women either in CI or normal individals.

　　【Key words】 Cerebral infarction; Gender;　βHaeⅢ; Polymorphisms (genetics); Fibrinogen

　　许多流行病学研究表明, 血浆纤维蛋白原浓度升高是脑卒中、冠心病和外周动脉疾病的一个独立的危险因素, 而且与纤维蛋白原基因改变有一定关系〔1〕。本研究应用PCR加酶切技术首次从基因分子水平探讨在脑梗死(CI)患者及健康者β纤维蛋白原基因启动子区HaeⅢ(βHaeⅢ)多态性分布频率及血浆纤维蛋白原浓度的性别间差异,通过探讨缺血性脑血管病的遗传易感性和发病机制,为其预防和治疗提供依据。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 CI组:共102例,男61,女41例, 年龄48～79(平均67)岁，均为山东大学齐鲁医院2006年6月～2007年5月急诊及住院病人,诊断依据1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的诊断标准,全部病例均经CT或MRI证实。对照组: 53 例,为同期山东大学齐鲁医院查体的老年人,其中男35例, 女18例,年龄46～82(平均65)岁。全部病例均为汉族人。二组在年龄、性别、吸烟、高血压、糠尿病、体重指数 (BMI)等方面相匹配,具有可比性。

　　1.2 研究方法 βHaeⅢ多态性分析及血浆纤维蛋白原浓度测定方法:早晨空腹, 肘静脉采血,分别用3.8%枸橼酸钠及2%乙二胺四乙酸( EDTA ) 抗凝(V∶V,9∶1),枸橼酸钠血浆标本用于纤维蛋白原浓度测定(Follin 酚法)。EDTA抗凝血分离白细胞, 用酚氯仿抽提方法提取人基因组DNA ,采用多聚酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段，主要参照Thomas等方法〔2〕。一对上下引物序列分别为: 5′-GGAATGCAATCTCTGCTACCT-3′,5′-TGTCGTTGACACCTTGGGAC-3′。PCR循环参数94℃预变性90 s, 继之进入30轮循环，93℃变性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸90 s,最后72℃延伸12 min。扩增目的基因片段长度约1. 3 kb。取30 μl PCR产物,加HaeⅢ限制性内切酶10～20 U, 37℃水浴消化2～ 4 h,最后放入2%琼脂糖凝胶电脉, 置超紫外灯下显影, 获得3种基因型: ①H1H1, 指在-455 碱基(bp )处有HaeⅢ酶切位点的纯合基因型,将1. 3 kb长的目的基因片段切成3条带: 575、383、343 bp。②H2H2, 指在-455 bp 处无HaeⅢ酶切位点, 故用HaeⅢ内切酶切不开,呈现两条带型: 958、343 bp。③H1H2,指两个等位基因其中一个在-455 bp 处无酶切位点,另一个有酶切位点,为杂合基因型, 酶切后呈现4条带型: 958、575、383、343 bp (见图1)。

　　1.3 统计学处理 用SPSS13.0软件，数据以x±s表示。相关性分析用多元线性回归分析方法,计量资料采用χ2检验。

　　1、3、5、6.H1H1; 2.H1H2;4.H2H2

　　图1 3种基因型的琼脂糖凝胶电泳结果(略)

　　2 结果

　　2.1 CI组与对照组男女βHaeⅢ多态性分布频率 两组βHaeⅢ多态性分布频率均存在性别间差异, 女性携带H1H2杂合基因型频率较男性稍高(P<0.05 );男性表现H2H2基因型,而女性未发现H2H2 基因型(见表1)。

　　2.2 不同性别βHaeⅢ多态性与血浆纤维蛋白原浓度关系 CI组男性血浆纤维蛋白原浓度较女性高(P<0.05，P<0.001)。见表1。

　　2.3 βHaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度的关系 相关分析结果显示βHaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度间存在极显著正相关。CI患者多表现为H1H2、H2H2基因型，故血浆纤维蛋白原浓度平均值明显高于正常对照组(见表1)。

　　2.4 吸烟与βHaeⅢ多态性和血浆纤维蛋白原浓度的关系 吸烟与βHaeⅢ多态性对血浆纤维蛋白原无相互作用(见表2)。

　　表1 CI组和对照组男女βHaeⅢ基因型分布频率及βHaeⅢ多态性与血浆纤维蛋白原浓度的关系(略)

　　与同组女性比较：1)P<0.05;2)P<0.001

　　表2 纤维蛋白原βHaeⅢ多态性、吸烟和CI的关系(略)

　　3 讨论

　　纤维蛋白原是一种急性期反应产物, 在组织损伤、感染、急性心肌梗死及脑卒中等应激情况下血浆纤维蛋白原浓度反应性升高, 并且受多种因素的影响, 尤以性别、激素水平和吸烟影响更甚〔1，3，4〕。现在的研究表明遗传对其也有影响，Hamsten〔5〕认为遗传对血浆纤维蛋白原浓度的影响约占51%。

　　纤维蛋白原由两个相同的亚单位以二硫键结合组成。每个亚单位由3条多肽链Aα、Bβ、γ组成，每条链由独立的mRNA转录，此3条基因相连成簇，均为不连续单一拷贝基因，它们共同位于4q23-32，大小约50 kb。纤维蛋白原的基因是协调转录的，实验表明增加任意1条链mRNA的转录均能促进其他链的mRNA转录，从而增加纤维蛋白原分子的合成和分泌。而纤维蛋白原Bβ链的mRNA的合成被认为是整个分子合成的限速步骤〔6〕。因此对纤维蛋白原基因多态性的研究主要集中于Bβ链。在纤维蛋白原基因簇上有11个多态性位点，其中2个位于编码区域(Kal、MnlⅠ)，9个位于侧翼和插入序列(KpnⅠ/SacⅠ、TaqⅠ、AvaⅡ、BclⅠA、BclB、BglⅠ、HinCⅡ、HindⅢ、HaeⅢ)。在纤维蛋白原基因Bβ链转录起始点上游5′侧翼序列有一个G/A-455DNA多态性位点，用限制性内切酶HaeⅢ消化可得到3种基因型，含有酶切位点的为H1型，不含此酶切位点的为H2型，从而产生3种不同的基因型H1H1，H1H2，H2H2型。对其与血浆纤维蛋白原浓度的关系还未达成一致意见。在阳性结果中多数提示H2H2基因型和高浓度的纤维蛋白原有关, 血浆纤维蛋白原浓度3.1%受控于HaeⅢ多态性位点〔7〕。

　　本研究发现无论是CI患者还是健康人群βHaeⅢ多态性分布频率均存在一定的性别间差异, 女性携带H1H2杂合基因型频率稍高，有统计学差异(P<0.05),男性表现H2H2基因型,而女性未发现H2H2 基因型。CI组男性血浆纤维蛋白原浓度较女性高(P<0.05) ,健康对照组男女间血浆纤维蛋白原浓度无统计学差异(P>0. 05)。目前有关这方面的研究文献报道不一致,多数报道认为〔1，3，4，8～10〕, H1H2、H2H2 基因型表现血浆纤维蛋白原浓度高, 且明显受吸烟、性别、激素水平的影响, 已经证明吸烟、妇女口服避孕药均可使血浆纤维蛋白原浓度增高。Wang 等〔10〕最近研究报道女性血浆纤维蛋白原浓度比男性高, 与本组研究结果不尽一致, 我们认为可能原因是国外妇女口服避孕药及吸烟者多见, 而本组研究人群中女性无1例吸烟和口服避孕药史, 而男性吸烟者多, 且量大, 在CI患者表现更为突出。为了解吸烟对血浆纤维蛋白原浓度是否有影响, 对此我们也作了相应分析, 结果与文献报道相一致。因此,积极提倡戒烟,高凝患者加强抗凝治疗,是预防和控制CI的关键。

　　【参考文献】

　　1 de Maat PM , de Knijff P, Green FR, et al. Gender-related association between β-fibrinogen genetype and plasma fibrinogen level and linkage disequilibrium at the fibrinogen locus in Greenland Inuit〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995;15: 856-60.

　　2 Thomas AE,Green FR,Humphries SF.Association of genetic variation at the beta fibrinogen gene locus and plasma fibrinogen levels;interaction between allele frequency of the G/A-455 polymorphism,age and smoking〔J〕.Clin Genet ,1996;50;184-90.

　　3 Humphries SE, Ye S, Talmud P,et al.European atherosclerosis research study: genotype at the fibrinogen locus (G-455-A B-Gene) is associated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in European. Evidence for gender-genotype-environment interaction〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995;15: 96-104.

　　4 Scarabin PY,Bara L, Ricard S,et al.Genetic variation at the β-fibrinogen locus in relation to plasma fibrinogen concentrations and risk of myocardial infarction. The ectim study〔J〕. Arterioscler Thromb, 1993;13:886-91.

　　5 Hamsten A,Iselius L,de Faire V,et al.Genetic and cultural inheritance of plasma fibrinogen concentration〔J〕. Lancet,1987;2(8566):988-91.

　　6 Roy S,Overton O,Redman C,et al.Overexpression of an fibrinogen chain by hepG2 cells specially elevates the expression of the two chain〔J〕. Biol Chem,1994;269:691.

　　7 Gardemann A,Schwartz O,Haberbosch W,et al.Positive association of the β-fibrinogen H1/H2 gene variation to basal fibrinogen levels and to the increase in fibrinogen concentration during acute phase reaction but not to coronary artery disease and myocardial infaction〔J〕.Thromb Haemost,1997;77:1120-6.

　　8 Thomas AE, Green FR, Kelleher CH,et al.Variation in the promoter region of the β-fibrinogen gene is associated with plasma fibrinogen levels in smokers and non-smokers〔J〕. Thromb Haemost, 1991;65: 487-90.

　　9 Behague I, Poirier O, N icaud V,et al.β-fibrinogen gene polymorphisms are associated with plasma fibrinogen and coronary artery disease in patients with myocardial infarction. The ectim study〔J〕.Circulation, 1996;93: 440-9.

　　10 Wang XL,Wang J, McCredie RM,et al.Polymorphisms of factor V, factor Ⅶ , and fibrinogen genes relevance to severity of coronary artery disease〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997;17:246-51.