头颈部恶性肿瘤中微卫星的不稳定性与杂合性缺失

作者：陈菲菲,祝威

作者单位：吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130021

 【关键词】  微卫星的不稳定性；杂合性缺失；头颈部恶性肿瘤；抑癌基因。

    癌症是一种基因病，并且越来越多的研究发现癌症与微卫星的不稳定性（MSI）和杂合性缺失(LOH)相关。微卫星（MS）是广泛存在于真核生物基因组中具有高度多态性的、非编码的、简单串联式核苷酸重复序列,具有介导基因重组、保持基因组稳定性的作用。MSI是指与正常组织相比，在肿瘤组织基因组中微卫星简单重复序列的增加或丢失，多是由于DNA错配修复功能的缺失所致。LOH是指一对染色体中的一条染色体发生了几千个核苷酸乃至一整条染色体遗传物质的缺失，多发生于抑癌基因的附近，是识别抑癌基因的标志。头颈部恶性肿瘤是我国东北地区常见的恶性肿瘤，主要包括口腔癌、鼻咽癌、喉癌及下咽癌，其中以喉鳞癌的发病率及死亡率居首。在致癌因素中，MSI与LOH则是近年来研究的新热点。且LOH被认为是在头颈部恶性肿瘤中较MSI发生频率更高的事件。

    3p区域的LOH大多发生于头颈部恶性肿瘤的早期，主要是3p14和3p21区，已证实3p区存在的肿瘤相关基因有FHIT和hMLH1。FHIT位于3p14.2区,编码Ap3A水解酶，此基因微卫星位点出现LOH可导致Ap3A在细胞内的堆积，增强生长信号传导途径，阻断抑制途径或凋亡通道，从而使肿瘤中细胞增值活性增强、恶性程度升高。Szukala K等人［1］在对多条染色体微卫星位点的研究中发现D3S1234（3p14区）在喉鳞癌组织中的缺失率最高，其在安全缘及喉部上方的正常黏膜中也有较低的LOH发生。所以，此区的LOH有助于判断喉鳞癌手术应切除的范围是否适当及癌症原位复发的几率。另一些对于FHIT附近位点的研究发现，其LOH与肿瘤的TNM分期，病理分级，淋巴结转移相关［2］，而此区MSI阳性多预示淋巴结转移的几率较大。表明此区域的微卫星改变是评价癌症的进展及预后的辅助指标。hMLH1位于3p21区，它是6个错配修复基因之一，其表达的异常（如基因发生LOH）可导致MSI及喉鳞癌的发生。Sanz-Ortega J等人［3］在喉癌众多微卫星位点的研究中发现3p21区LOH的发生率高达87％，而从角化到重度不典型增生，LOH的发生率逐渐上升。此区的LOH与肿物癌变具有相关性，是判断癌症高发危险度的指标，提示hMLH1的表达及功能的异常。3p21区的LOH在对评价的喉鳞癌治疗中也有一定意义，早期的喉鳞癌经放疗后复发的肿瘤组织中3p21区的LOH发生率较放疗前高［4］，LOH的发生有助于发现放疗耐受的肿瘤细胞，指导临床治疗方案。另外，少许研究发现在3p24-25区域在喉癌中亦常发生LOH事件［5］，提示此区可能有潜在的抑癌基因存在，例如VHL，但其是否参与HNSCC的发生机制尚有待于进一步研究。

    7q区域的微卫星异常被认为是头颈部鳞状细胞癌（SCCNH）的原发性染色体改变，特别是7q31.1-7q31.2区，众多研究中此区出现LOH的频率最高。Gunduz M等人［6］以49例头颈部肿瘤患者作为研究对象，发现D7S643和D7S486位点LOH的频率较高，在明确此位点附近的基因定位时，发现ING3基因位于D7S643附近，而且在原发性肿瘤中，50％ING3蛋白表达减少或不表达，与肿瘤的发病率升高相关。ING3属于ING家族，这个基因家族最早是通过消减杂交寻找抑癌基因的方法得到的,功能上与染色质结构的调节、基因转录、细胞周期调控、细胞增殖以及凋亡相关，ING基因家族具有相似的基因结构，目前研究较多的是ING1及ING4,其参与多种肿瘤的发生及发展，所以ING3应在SCCNH中起抑癌基因的作用。

    9p是SCCNH中最为常见的微卫星不稳定区域之一。Xu XF等人［7］对9p13-23区域的研究中发现42例喉鳞癌中共有41例至少在一个微卫星位点上发现LOH,发生率最高的两个区域分别是在9p21和9p22-23，由此可推测此区至少存在两个抑癌基因参与喉鳞癌的发生机制，但LOH的发生与喉鳞癌的T分期及病理分级无关联。而其他对喉鳞癌颈部转移淋巴结的研究发现，其LOH的发生与肿瘤的分化程度及临床分期相关，其中位于9p21的D9s171位点的缺失是评价肿瘤淋巴结转移及癌症预后的指标［8］。另外，在口腔癌的研究方面，段宁等人［9］对不同分期的癌前病变及口腔癌做了研究，发现9p21区域有MSI的存在。MSI在口腔癌前病变癌变早期即已发生，而LOH发生频率则随口腔癌前病变癌变的发生发展逐渐增高。所以微卫星的改变明确与肿瘤的发展相关。p16基因位于9p21区，其编码的p16蛋白和CDK4或CDK6结合，在G0期控制细胞增生，在正常细胞中具有调节细胞生长，诱导细胞分化及程序化死亡，有维持基因组稳定性的功能，所以此基因的失活将促使细胞异常增殖，导致肿瘤的发生，促进肿瘤发展及恶化。p16抑癌基因区的杂合性缺失往往与甲基化并存，Smigiel R等人［10］的研究表明在喉鳞癌中，p16区域的LOH和启动子区域的甲基化的发生率大致相等，其中发现p16蛋白表达减少的几率各为73.33%和80.95%，并随与肿瘤分期呈正相关，故推测两者相互作用导致p16的失活。而在其他头颈部恶性肿瘤：如口腔癌﹑下咽癌的研究中，p16基因的失活亦起重要作用,但p16基因失活的癌症患者复发的几率较低［11］，所以，除了p16基因以外，应该还有其他的抑癌基因存在。

   11p13和11p15区域的LOH是与头颈部肿瘤发生相关的特殊区域。在对头颈部肿瘤患者的正常黏膜及原位癌的研究中，肿瘤组织中有50.9%发生微卫星的改变，而LOH占45.5%，11p15区域的LOH发生率高于11p13区域，LOH与肿瘤的组织学低分化及细胞高度异常增殖相关，提示此区域存在潜在的肿瘤抑癌基因［12］。11p15.5附近同时存在着IGF2和H19两种连锁基因，IGF2和H19分别是父源表达和母源表达的印迹基因,基因组印迹是一种依赖配子起源的某些等位基因修饰现象,参与此现象的基因称为印迹基因。它们发生印迹的机制甚为复杂。IGF2被认为是生长因子的一种，而H19则被认为起抑癌基因的作用，所以LOH的发生导致抑癌基因的失活，而同时生长因子的表达增加，从而使细胞异常增殖，肿瘤发生。IGF2和H19广泛参与多种肿瘤的发生,发展及恶化。Rainho CA等人［13］在头颈部肿瘤的研究中，发现11p15.5区域附近有LOH的发生，并与IGF2单等位基因的表达呈正相关。11p13区是否存在肿瘤相关基因并未明确。

    13q区域的LOH也是SCCHN常见的现象，Katarzyna Szukala等人［14］的研究表明LOH在染色体的13q14和13q34区域都有很高的发生率，并且在安全缘及肉眼正常的组织中也有LOH的存在，这可能是预测肿瘤在此区解剖域原位复发的重要指标。抑癌基因RB1基因位于13q14.2，在侵袭性喉鳞癌中，RB1基因附近的LOH可达100％，其中少部分可见p110RB1蛋白的表达缺失，而在原位癌中无LOH的发生［15］。所以LOH缺失导致RB1基因的失活在喉鳞癌侵袭发展过程中有重要作用。ING1定位于13q34，其所编码的蛋白有p33ING1b、p24INGlc等，p33INGlb与Sin3形成阻抑复合物抑制p53下游基因，使细胞周期受到阻滞，p24INGlc与p53依赖性启动子相互作用，拮抗这种抑制。因此，p33INGlb与p24INGI的相对比例，决定了p53基因的活性及细胞增殖的可能性，所以ING1作为抑癌基因的候选基因是通过p53起作用的。相比之下，在HNSCC中LOH较多出现在RB1区域。13q区域另外一个抑癌基因就是BRCA2，位于13q12.-13，其基因附近的LOH在乳腺癌中较为常见，在Kirkpatrick H［16］等人的研究中发现BRCA2附近有LOH事件发生，但LOH的病例中并未发现BRCA2基因的突变，其与HNSCCS的相关性并不确定。在喉癌的研究中除了以上区外，13q21.1-22.1﹑13q31.1-32.3区也有较高的LOH发生［17］，G1期13q32区域的缺失率很高，而13q22区域的缺失与肿瘤的大小相关［18］。所以，这些区域应该存在尚未人知的抑癌基因，并参与致癌机制。

    17号染色体区域,尤其是17p13在头颈部肿瘤中较常发生LOH。抑癌基因p53定位于17P13.1，它编码的p53蛋白通过与DNA结合或反式激活，调节其他蛋白的表达，从而参与转录调控，起到抑癌基因的作用。P53基因的改变多发生于其第72位密码子（精氨酸或脯氨酸），Schneider-Stock R等人［19］在对54例头颈部鳞癌的研究中发现p53的LOH率为45.2%，并以脯氨酸等位基因最多。脯氨酸等位基因附近的LOH可导致Bcl-2基因的表达增加及Fas/FasL基因的共同表达缺失，从而损伤细胞凋亡机制，导致肿瘤发生。在Rizos E等人［20］的研究中也可见17p13的LOH，并且在喉鳞癌及癌前病变中的总发生率占(54%)，故其在癌症的早期起重要作用，有助于筛选肿瘤高危人群及辅助临床初步诊断。此外，17p区尚存在另一抑癌基因：BRCA11，它位于7p21区，是细胞周期监测点调控的重要因子，有研究表明［21］BRCA1基因区域的MSI可作为中国人散发性胃癌早期的分子学标志,LOH发生在胃癌的晚期,可被看作预后指标。但头颈部鳞癌的发生是否与此基因位点的微卫星改变相关，尚需进一步研究。研究还发现，17p区域的LOH发生与吸烟及饮酒等外界环境因素密切相关［22］，可用于流行病学的研究。

    18q区LOH的频率也很高，并被视作是癌症的晚期事件，预示癌症的预后较差，但其具体的致癌机制尚未十分明确。Rowley H等人［23］在头颈部鳞状细胞癌的研究中发现18q区域的LOH或MSI的总发生率高达49％，LOH发生率最高的区域是在18q21.1-21.3。DDC定位于此区，是抑癌基因的一种，编码细胞膜蛋白，是细胞表面信号转导受体，抑制肿瘤细胞的复制。但目前并没有明确研究证明与此基因与癌症相关，这可能提示在18q21区域存在其他相关的抑癌基因，也许是DPC4或MADR2，DPC4和MADR2同属Smad基因家族，其异常可阻止TGF-β的作用，促进肿瘤的形成，也许还有其他尚未被发现的抑癌基因。

   除了以上所说的染色体区域以外，还有其他一些染色体可见微卫星位点的改变发生。例如：有研究表明6号染色体存在一些肿瘤抑制基因，而IGF1R就应该是其中之一，IGF1R是一种有效的生长抑制因子，其脆性位点在6q25.3附近，喉鳞癌中6q25.3区的LOH及MSI总发生率为68.2％［24］，并且在胸腺瘤的研究中LOH发生频率最高的位点也是6q25.2(48.6%)［25］。在鼻咽癌的研究中，16q22-24区域有不同程度的LOH及MSI出现［26］，此区存在的肿瘤相关基因有CMAR及CDH13，其在多种肿瘤中有表达下调及缺失的发生，对解释此区微卫星的不稳定性有重要意义。22q微卫星的改变亦与头颈部肿瘤的部位相关，口腔癌在22q13.1-13.31区域LOH的发生率很高，而喉癌发生率高的区域为22q11.2.1-12.1，不同解剖区域的肿瘤其LOH发生的位点有明显差异［27］，22q区域的LOH与喉癌及口腔癌的致癌机制相关，但与下咽癌的发生无明显关系。故此区域存在至少两种抑癌基因，并且在不同的肿瘤中起作用。另外还有1p34.1-36.3［18］,2q14-21和2q36［28］,8q.8p12和8p22-23［29］，这些区域在头颈部肿瘤中都有微卫星的改变发生，提示有抑癌基因的存在，但尚未被确定。

    从微观的角度讲，Woo Jeong Yoo等人［30］的研究表明：在喉鳞状细胞癌的所有分期中，包括鳞状上皮化生，异常增殖，侵袭性癌及转移癌中都存在着9p21区的LOH；17p13.1,3p25和3p14.2位点的LOH出现在鳞状上皮异常增生，侵袭癌以及转移癌中，8p21.3-p22区的LOH主要发生在侵袭癌和转移癌中。故9p21区的LOH是喉鳞状细胞癌进程中的早期事件，17p13.1,3p25和3p14.2的缺失是疾病进程中的中期事件，而8p21.3-p22区的染色体缺失则多发生在癌症的晚期。此种微观的、综合的研究是微卫星改变研究的新进展，亦是将来基础及临床研究的新方向。

【参考文献】  　　［1］Szukala K,Sowinska A,Wierzbicka M,et al. Does loss of heterozygosity in critical genome regions predict a local relapse in patients after laryngectomy?［J］.Mutat Res，2006，600(1-2):67.

　　［2］Yin DT,Dong MM.Microsatellite instability and loss of heterozygosity of fragile histidine triad gene in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi.2005，40(1):45.

　　［3］Sanz-Ortega J,Valor C,Saez MC,et al.3p21,5q21,9p21 and 17p13 allelic deletions accumulate in the dysplastic spectrum of laryngeal carcinogenesis and precede malignant transformation［J］.Histol Histopathol，2003，18(4):1053.

　　［4］Ogawa T,Shiga K,Tateda M,et al.Protein expression of p53 and Bcl-2 has a strong correlation with radiation resistance of laryngeal squamous cell carcinoma but does not predict the radiation failure before treatment［J］.Oncol Rep，2003，10(5):1461.

　　［5］Bockmuhl U,Petersen I,Dietel M，et al.Allele losses in squamous cell carcinomas of the larynx［J］.Laryngorhinootologie，1996，75(1):48.

　　［6］Gunduz M,Ouchida M,Fukushima K,et al.Allelic loss and reduced expression of the ING3,a candidate tumor suppressor gene at 7q31,in human head and neck cancers［J］.Oncogene，2002，21(28):4462.

　　［7］Xu XF,Gao YN,Cheng SJ.Detailed deletion mapping of loss of heterozygosity on 9p13-23 in laryngeal squamous cell carcinoma by microsatellite analysis［J］.Chin Med J (Engl)，2004，117(8):1204.

　　［8］Li B,Xu Y.Study on loss of heterozygosity at microsatellite locus in larynx and pharynx squamous cell carcinoma and neck lymph nodes［J］.Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi，2004，18(6):321.

［9］段 宁，王文梅，王亚平，等.白斑及鳞癌9p微卫星位点改变及与病理的关系［J］.临床口腔医学杂志，2005，21（4）：240.

　　［10］Smigiel R,Sasiadek M,Krecicki T,et al.Inactivation of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) gene in squamous cell carcinoma of the larynx［J］. Molecular Carcinogenesis,2004,39:147.

　　［11］Koscielny S,V Eggeling F,Dahse R.Investigations to the in fluence of tumor supressor gene p16 inactivation on the prognosis of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Laryngorhinootologie,2004,83(6):374.

　　［12］Adel K,El-Naggar,Kenneth Hurr,et al.Allelic loss and replication errors at microsatellite loci on chromosome 11p in head and neck squamous carcinoma:association with aggressive biological features［J］.Clinical Cancer Research1996,2:903.

　　［13］Rainho CA,Kowalski LP,Rogatto SR.Loss of imprinting and loss of heterozygosity on 11p15.5 in head and neck squamous cell carcinomas［J］.Head & Neck,2001,10:851.

　　［14］Katarzyna Szukala,Jurgen Brieger,Katharina Bruch,et al.Loss of heterozygosity on chromosome arm 13q in larynx cancer patients:analysis of tumor,margin and clinically unchanged mucosa［J］.Med Sci Monit,2004,10(6):233.

　　［15］ Bai S,Fei S,Zhang X.Loss of heterozygosity on chromosome RB1.20 locus and p110RB1 protein state in squmous cell carcinomas of larynx［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi,1998,33(2):110.

　　［16］Kirkpatrick H, Waber P,Hoa-Thai T,et al. Infrequency of BRCA2 alterations in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oncogene,1997,8:14(18):2189.

　　［17］Stembalska A,Blin N,Ramsey D,et al.Three distinct regions of deletion on 13q in squamous cell carcinoma of the larynx［J］.Oncol Rep,2006,16(2):417.

　　［18］Kamilla Schlade-Bartusiak,Agnieszka Stembalska.Significant involvement of chromosome 13q deletions in progression of larynx cancer,detected by comparative genomic hybridization［J］.J Appl Genet,2005,46(4):407.

　　［19］Schneider-Stock R，Mawrin C,Motsch C,et al.Retention of the arginine allele in codon 72 of the p53 gene correlates with poor apoptosis in head and neck cancer［J］.Am J Pathol,2004，164(4):1233.

　　［20］Rizos E,Sourvinos G,Spandidos DA.Loss of heterozygosity at 8p,9p and 17q in laryngeal cytological specimens［J］.Oral Oncol,1998,34(6):519.

　　［21］Chen XR,Zhang WZ,Lin XQ,et al.Genetic instability of BRCA1 gene at locus D17S855 is related to clinicopathological behaviors of gastric cancer from Chinese population［J］.World J Gastroenterol,2006,12(26):4246.

　　［22］Miracca EC,Yamamoto L,Contado D,et al.Distinct chromosomal deleted regions defining different subsets of head and neck tumors［J］.Diagn Mol Pathol,2000,9(4):229.

　　［23］Rowley H,Jones AS,Field JK.Chromosome 18:a possible site for a tumour suppressor gene deletion in squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Clin Otolaryngol Allied Sci,1995,20(3):266.

　　［24］康 宁，徐振明，李福才，等.喉癌染色体6q25区域的杂合性丢失和微卫星不稳定性分析［J］.中国医科大学学报， 2003，32（4）：289.

　［25］Inou M,Marx A,Zettl A,et al.Chromosome 6 suffers frequent and multiple aberrations in thymoma［J］.Am J Pathol,2002,161(4):1507.

　　［26］鄢 践，方 嬿，黄必军，等.鼻咽癌染色体16q2224遗传不稳定性的研究［J］.癌症，2001，20（6）：588.

　　［27］Reis PP,Poli-Frederico RC,Santos RM,et al.Distinct regions of loss of heterozygosity on 22q in different sites of head and neck squamous cell carcinomas［J］.Med Sci Monit,2002,8(3):BR89.

　　［28］Numasawa H,Yamamoto N,Katakura A,et al.Loss of heterozygosity and microsatellite instability on chromosome 2q in human oral squamous cell carcinoma［J］.Bull Tokyo Dent Coll,2005,46(1-2):17.

　　［29］Sasiadek M,Stembalska-Kozlowska A,Smigiel R,et al.Microsatellite and chromosome instability in squamous cell laryngeal carcinoma［J］.Int J Oncol,2001,19(2):401.

　　［30］Woo Jeong Yoo,Seung Ho Cho.Loss of heterozygosity on chromosomes 3p,8p,9p and 17pin the progression of squamous cell carcinoma of the larynx［J］.J Korean Med Sci,2004,19(3):345.