IL9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平

　　作者：吉均祥1， 钱 炜1， 邹 晨1， 马永明1， 林志强1， 陈建国1， 杨先知2， 王胜军2 作者单位：(1.江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科， 江苏 镇江 212002; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学系， 江苏 镇江 212013)

　　【摘要】 目的： 检测变应性鼻炎患者IL9的表达水平,探讨IL9在变应性鼻炎发生发展中的意义。方法： 收集49例变应性鼻炎患者的外周血标本，其中未治疗组30例，临床缓解组19例，另取30例健康志愿者的外周血标本作为正常对照组。采用实时荧光定量PCR(QRTPCR)检测IL9基因在外周血中的表达水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆IL9含量。结果： 变应性鼻炎未治疗组外周血单个核细胞中IL9 mRNA表达水平及血浆IL9含量明显高于变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组(P<0.05)，而变应性鼻炎临床缓解组与正常对照组比较差异无统计学意义。变应性鼻炎未治疗组IL9 mRNA表达水平与临床评分呈正相关。结论： 变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中IL9呈高表达。IL9可能参与了变应性鼻炎的病理过程，具体机制有待进一步探讨。

　　【关键词】 变应性鼻炎; 白细胞介素9; 实时荧光定量PCR

　　Expression of IL9 in peripheral blood mononuclear cellwith allergic rhinitis patients

　　JI Junxiang1, QIAN Wei1, ZOU Chen1, MA Yongming1, LIN Zhiqiang1, CHEN Jianguo1,

　　YANG Xianzhi2, WANG Shengjun2

　　(1.Department of Otolaryngology, the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; 2.Department of Immunology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China)

　　[Abstract] Objective: To establish a method of realtime fluorescence quantitative PCR for detecting IL9 mRNA in human peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and investigate the relationship between the expression of IL9 and allergic rhinitis (AR). Methods: The mRNA levels of IL9 in PBMC were determined by quantitative realtime PCR (QRTPCR), and detected the concentrations of IL9 in plasma by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in 49 patients, including 30 untreated AR patients and 19 patients in recovering phase, and 30 healthy control volunteers. Results: IL9 mRNA expression and IL9 concentrations in the group of 30 AR patients without treatment were markedly higher than that in the groups of 19 AR patients in clinical remission and 30 healthy controls (P<0.05). but there were no significant differences between the groups of AR in clinical remission and normal control (P>0.05). Furthermore, the result of this study shows a positively correlated between IL9 mRNA and clinical count in untreated AR patients. Conclusion: These results indicated that IL9 was higher in AR patients without treatment, and suggesting that IL9 might be involved in the pathological process of AR. The role of IL9 in process of AR remains further investigation.

　　[Key words] allergic rhinitis; IL9; realtime quantitative PCR

　　变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 又称过敏性鼻炎，是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一，其发病率有逐渐增高的趋势[1]。IL9可通过抑制嗜酸性粒细胞的凋亡和促进IL5介导的嗜酸性粒细胞前体的成熟来增加组织中的嗜酸性粒细胞[2-5];另外，IL9能增加肥大细胞表面IgE高亲和受体α(FcεR Iα)的表达和产生炎症介质的量, 使得肥大细胞对变应原做出反应[5];并可刺激上皮细胞而导致嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞的浸润，诱导上皮细胞表达产生粘蛋白[3-6];同时，IL9还可通过作用于平滑肌细胞来招募嗜酸性粒细胞，进而促进IL8的释放来招募更多的中性粒细胞, 从而在炎症的发生发展中起到重要作用[7-9]。本研究通过检测变应性鼻炎患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中IL9 mRNA的相对表达水平和外周血中IL9蛋白的表达水平，以探讨其在变应性鼻炎中的表达变化及与变应性鼻炎发生、发展的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 临床资料及标本 AR患者未治疗组为按照中华医学会耳鼻喉科学分会2004年兰州会议变应性鼻炎诊断标准[10]，2008年12月至2009年9月在江苏大学附属人民医院就诊的30例患者(男14例，女16例，年龄13～49岁，平均29岁)，均有AR典型症状，经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等20种常见阳性变应原血清特异性IgE检测，至少一种为阳性;临床缓解组为AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷剂雷诺考特、辅舒良、内舒拿等药物治疗后(每日2次，每次1～2喷)临床症状缓解1个月后复诊，并经疗效评分标准显示为有效或显效的19例患者(男9例，女10例, 年龄14～39岁，平均年龄24岁)。另选30例健康志愿者作为正常对照组(男14例，女16例, 年龄18～42岁，平均年龄27岁)，均无AR病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史，吸入组变应原血清特异性IgE过筛试验检测阴性。根据AR症状和体征评分方法筛选AR临床缓解组患者。

　　疗效判定标准：(治疗前总分-治疗后总分)/治疗前总分×100%，≥66%为显效，65%～26%为有效，≤25%为无效。

　　AR未治疗组的30例患者经治疗后，其中20例为显效，5例为有效，5例为无效，25例有效或显效患者停药1个月后有3例重新出现部分症状且评分低于显效标准。我们去除无效及症状复发的，取19例显效和有效且停药1个月症状未复发的为临床缓解组。

　　1.1.2 主要试剂 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制剂公司)，Trizol (Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(TOYOBO公司)，SYBR Premix Ex Taq、PMD18TA克隆试剂盒(TaKaRa公司),人IL9 ELISA试剂盒(eBiosience公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物设计及合成 根据基因库中目的基因序列，用Premier 5.0软件设计目的基因检测引物，由上海生物工程技术公司合成，序列见表1。表1 QRTPCR检测引物序列及扩增范围

　　1.2.2 PBMC的分离 用肝素抗凝管收集健康志愿者、AR患者外周血2 ml，PBS以1∶1稀释，混匀，沿管壁轻缓移入放有等体积Ficoll泛影葡胺(人淋巴细胞分离液)离心管，1 500 r/min，15 min，离心半径10 cm，吸取分层液的云雾层，PBS洗涤，RPMI1640完全培养基(10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)重悬，计数，以1×106 个细胞/ml加1 ml Trizol，置-70 ℃冰箱冻存。

　　1.2.3 构建目的基因质粒标准品 以上述制备的cDNA为模板，选取下列最佳的特异性扩增条件：① 反应体系：10×PCR 缓冲液2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物各0.3 μl(10 pmol/L)，cDNA模板1.0 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.2 μl，MgCl2(25 mmol/L) 0.8 μl，ddH2O 13.3 μl。② 反应条件：变性，94 ℃ 30 s;退火,IL9 58 ℃ (β肌动蛋白56 ℃) 30 s;延伸,72 ℃ 30 s，35个循环。将目的基因PCR扩增产物TA克隆，转化DH5α感受态，挑取阳性克隆质粒，并送上海生物工程公司测序鉴定。所选阳性质粒倍比稀释至108～104拷贝数/μl，备用。

　　1.2.4 RotorGene 6000荧光定量PCR仪检测目的基因表达 采用绝对定量法检测目的基因mRNA的表达水平，SYBR Green Ⅰ法检测荧光。所有样本的检测值都用β肌动蛋白进行校准。

　　1.2.5 统计学处理 所有数据应用SPSS17.0统计软件中KruskalWallis H检验，3组数据进行两两比较利用Nemenyi法检验，采用Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 IL9和β肌动蛋白基因PCR扩增产物

　　以AR患者外周血cDNA为模板，PCR扩增IL9和β肌动蛋白基因，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图1。

　　1: DL2000标准参照物; 2: IL9; 3: β肌动蛋白

　　图1 AR患者外周血IL9和β肌动蛋白

　　PCR扩增产物鉴定

　　Fig 1 Identification of amplification of IL9 and βactin

　　by PCR in patients with AR

　　2.2 实时荧光定量PCR法建立β肌动蛋白和IL9标准曲线

　　以β肌动蛋白各梯度浓度标准质粒为模板，定量PCR扩增β肌动蛋白，重复3次。图2a为熔解曲线，未见杂峰，表明扩增特异性较好;图2b为QRTPCR扩增动力学曲线，呈典型的S形，平台期汇于一条直线上，指数区明显，斜率大且固定(平行线);图2c为定量结果，显示标准品浓度梯度对应的扩增后的拷贝数;图2d中标准曲线的斜率为3.371;截距为40.703;相关系数为为0.99;扩增效率0.98。以不同浓度梯度IL9标准质粒为模板，QRTPCR扩增IL9，重复3次。图3a为熔解曲线，峰尖在同一中轴上，表明扩增特异性较好;图3b为QRTPCR扩增动力学曲线，平台期集中同一直线上，指数区明显，斜率固定;图3c为定量结果，显示与标准品浓度梯度相对应的扩增后的拷贝数;图3d中标准曲线的斜率为3.513;截距为34.214;相关系数为0.999;扩增效率为0.93。

　　2.3 AR患者未治疗组、AR临床缓解组与健康对照组IL9 mRNA表达比较

　　实时荧光定量PCR方法检测3组IL9 mRNA相对表达。结果显示，AR未治疗组、AR临床缓解组和正常对照组之间IL9 mRNA相对表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中，AR 未治疗组IL9 mRNA的相对表达水平明显高于临床缓解组和正常对照组(P<0.01);而临床缓解组IL9 mRNA的相对表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

　　2.4 AR 患者IL9 mRNA 相对表达水平与症状、体征记分相关性分析

　　结果表明，AR患者未治疗组IL9 mRNA 相对表达水平与症状、体征记分呈正相关(n=30,r=0.602,P<0.001)。见图5。

　　2.5 AR患者血浆IL9表达水平

　　30例AR未治疗患者、19例AR临床缓解者和30例健康志愿者的血浆严格按IL9 ELISA试剂盒操作说明检测，采用非参数秩和检验统计分析，结果以箱图表示(图6)，AR未治疗患者血浆IL9的含量高于AR临床缓解者和健康志愿者(P<0.05)，AR临床缓解者和健康志愿者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　在哮喘病患者体内，IL9作用于炎症细胞和组织细胞，使淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞的量增多，提高了IgE的分泌量，增强了肥大细胞对变应原的反应，诱导黏蛋白的表达，并促进炎症细胞分泌一些细胞因子参与炎症反应。随着研究的进一步发展，还认为IL9在气道高反应性和哮喘表型中起了重要的作用[11, 12]。

　　本研究检测了AR患者外周血单个核细胞中IL9 的mRNA和蛋白表达水平，结果发现AR患者未治疗组IL9的表达水平高于AR患者临床缓解组和健康对照组，而AR患者缓解组与健康对照组IL9的表达水平无显著性差异，提示AR患者体内存在着IL9的高表达，进一步研究表明IL9的表达水平与疾病的临床评分呈正相关。提示了IL9在AR的发生发展中可能起着重要的作用。

　　Nicolaides等[12]的体外试验已经证实IL9的产生与Th9的数量密切相关，而IL9又可促进Th9细胞分泌IL9，并具有维持Th9表型的功能，因而，有可能在变应性疾病免疫内环境IL9促进了Th9细胞的分化，而Th9的增多使得IL9的分泌又增多，从而形成一条正反馈的效应。这一机制的存在还有待于进一步探讨。

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