缺氧因子在人鼻黏膜上皮细胞的表达研究

　　作者：杨琳红 董震 王维峰 作者单位：吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 探讨在感染性因子、炎性因子的作用下人鼻黏膜上皮细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达情况。方法 无血清原代培养人鼻息肉及下鼻甲黏膜上皮细胞，以脂多糖(LPS)10，100，1 000 ng/ml，白细胞介素-1β(IL-1β)20 ng/ml作用于对数生长期的上皮细胞3，6，9 h后，采用免疫细胞化学方法和原位杂交方法检测HIF-1α蛋白及mRNA的表达情况。结果 ①鼻黏膜上皮细胞在感染性因子LPS作用下，HIF-1α表达增加并且具有时间依赖性和计量依赖性，其中以100 ng/ml，6h表达最明显(P<0.05);②鼻黏膜上皮细胞在炎性因子IL-1β的作用下，HIF-1α表达趋势同LPS组，表达强度略低于LPS 100 ng/ml，但二者无显著性差异;③各组因素作用下鼻息肉组HIF-1α的表达明显高于下鼻甲组(P<0.05)。结论 感染性因子、炎性因子作用下鼻黏膜上皮细胞表达HIF-1α增加，进而诱导相关因子的大量表达，是鼻息肉发生发展的重要原因之一。

　　【关键词】 慢性鼻窦炎鼻息肉;上皮细胞;细菌脂多糖;白细胞介素-1β;缺氧诱导因子-1

　　基金项目：国家“十一五”科技攻关项目资助(编号：2007CB516706)

　　Expression and the role of HIF-1α in human nasal epithelium mucosae cells

　　YANG Lin-Hong, DONG Zhen, WANG Wei-Feng.

　　Department of Otorhinolaryngology, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin, China

　　【Abstract】 Objective To observe the expression and the role of hypoxic inducible factor (HIF)-1α induced by inflammatory factor and infection factor in primary human nasal epithelial cell (HNEC).Methods Epithelial cells of nasal polyps (NP) and inferior turbinate (IT) were cultured without serum under stimulus of LPS 10，100, 1 000 ng/ml and IL-1β 20 ng/ml for 3，6，9 h respectively. The expression of HIF-1α protein and mRNA derived from epithelial cells was detected by immunocytochemistry and in situ hybridization.Results ① The expression of HIF-1α increased under the stimulus of inflammatory factor with the increasing of time and concentration, especially by LPS 100 ng/ml at 6 hour(P<0.05);②The expression tendency of HIF-1α induced by IL-1β was the same as that by LPS groups, and the expression intensity of HIF-1α induced by IL-1β was lower than that by LPS 100 ng/ml, but there was no differences between them. ③The HIF-1α expressed more intensively in epithelial cells from NP than IT under all conditions (P<0.05); Conclusions Epithelial cells actively produce vast HIF-1α under inflammatory factor and infection factor to induce overexpressed correlated factors, which is one of important factors of formation of NP.

　　【Key words】 Chronic sinusitis-nasal polyps;Epithelial cells;Bacterium lipopolysaccharide; Interleukin-1β; Hypoxic inducible factor (HIF)-1α

　　近年来人们发现多种细胞因子在鼻息肉中存在并影响其发生、发展及病理变化。缺氧诱导因子-1(hypoxic inducible factor-1，HIF-1)就是其中重要的因子。HIF-1是近年来发现的一种机体适应缺氧的重要的转录调节因子，其中HIF-lα蛋白的稳定性在调控HIF-l的表达中起关键限速作用〔1〕。目前关于HIF-1α促进肿瘤发生发展的机制已有广泛研究〔2〕，但HIF-1α在炎症的病理机制中，尤其炎症刺激是否诱导HIF-1α的表达以及它在慢性鼻窦炎鼻息肉中的作用还有待于进一步研究。本实验以感染性因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)作用于体外原代培养的人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells，HNEC)，研究HIF-1α蛋白及基因的表达情况，以探讨其在老年慢性鼻窦炎、鼻息肉发生发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料来源 鼻息肉组织来源于2005年9月至2007年6月行手术治疗的慢性鼻窦炎鼻息肉患者(鼻息肉组) 共22例，男14 例，女8 例，年龄55～76(平均62.2)岁。下鼻甲黏膜组织来源于鼾症行下鼻甲切除术的患者(下鼻甲黏膜组)共8例，男6例，女2例。全部患者均行鼻息肉摘除术，术前2 w均未使用过糖皮质激素、抗组胺类药物，无阿司匹林耐受不良。

　　1.2 HNEC的分离与培养 参照Wu等〔3〕的方法将鼻内窥镜下鼻息肉摘除术及鼻甲切除术取下的标本立即放入4℃ PBS(含有100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)缓冲液中冲洗多次，然后放入0.25%胰蛋白酶中，4℃消化16～18 h后，制成细胞悬液。经台酚蓝染色证明细胞活性>90%，稀释细胞悬液至1×105/ml，接种于细胞培养瓶中，CO2孵箱(37℃，5% CO2)孵育1h，去除成纤维细胞后，转入6孔培养板中(培养板中预先放入0.05%多聚赖氨酸处理过的盖玻片)，生长因子培养基培养(DMEM/F12培养基中加入以下生长因子：5 μg/ml胰岛素，10 ng/ml霍乱毒素，5 μg/ml转铁蛋白，100 ng/ml维生素A酸，0.36 μg/ml氢化可的松，20 ng/ml三碘甲状腺氨酸，3.75 μg/ml内皮细胞生长因子，25 ng/ml表皮生长因子，均购自美国Sigma公司)，隔天换液，进行无血清原代培养4～5 d，上皮细胞呈单层接近完全融合。

　　1.3 不同因素作用于HNEC 给予刺激前24 h将生长因子培养基更换为不含任何添加因子的DMEM/F12培养基。上皮细胞分为二组，次日分别给予①LPS(购自武汉博士德生物公司)10，100，1 000 ng/ml;②IL-1β(购自美国Cytolab/Peprotech Asia公司)20 ng/ml;作用3，6，9 h后，检测HIF-1α蛋白及mRNA表达水平。

　　1.4 免疫细胞化学 SABC免疫组化试剂盒(购自武汉博士德公司)检测鼻息肉与下鼻甲黏膜上皮细胞经上述炎性因子刺激后HIF-1α蛋白表达情况。实验按照试剂盒提供的方法和步骤进行，抗体浓度为1∶100，以PBS替代一抗作为阴性对照。DAB显色试剂盒(购自武汉博士德公司)显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜观察。

　　1.5 原位杂交 采用HIF-1α原位杂交试剂盒(购自武汉博士德公司)检测鼻息肉与下鼻甲黏膜上皮细胞经炎性因子作用后HIF-1α mRNA的表达。HIF-1α的探针序列为：5′-TTAGT AGCTT GCTCA TCAGT TGCCA CTTCC-3′;5′-CTCAG TTTGA ACTAA CTGGA CACAG TGTGT-3′;5′-GGCCG CTCAA TTTAT GAATA TTATC ATGCT-3′。实验按照试剂盒提供的方法和步骤进行。用未加探针和继胃蛋白酶消化后用核糖核酸酶处理者作为阴性对照。

　　1.6 统计学处理 每张片子在200倍光镜下随机选取5～10个视野，应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统分析细胞内蛋白表达及杂交产物的平均灰度值(灰度值与表达成反比)，应用统计软件SPSS10.0软件包对资料进行方差齐性检验、方差分析。

　　2 结果

　　2.1 HNEC在LPS、IL-1β作用下HIF-1α蛋白和mRNA的表达 HIF-1α蛋白和mRNA在上皮细胞均有阳性表达，主要表达在细胞核，胞浆也有表达，呈棕黄色，对照组(无刺激因子)上皮细胞几乎未见阳性表达(图1)。LPS组HIF-1α表达呈时间和浓度依赖性，由3 h到6 h表达逐渐升高，6 h达到最高，6 h到9 h逐渐下降，并且以100 ng/ml，6 h时表达最明显(P<0.05)(表1);IL-1β组阳性表达增加，棕黄色加深，表达趋势基本同LPS组，表达强度低于LPS组，但差异无显著性。在各种作用条件下鼻息肉组HIF-1α表达均明显高于下鼻甲组(P<0.05)(表2)。

　　表1 LPS 100 ng/ml作用于鼻息肉上皮细胞不同时间段HIF-1α蛋白和 mRNA的表达灰度值(略)

　　图1 HIF-1α蛋白及HIF-1α mRNA的表达(略)

　　表2 不同因素作用6 h HNEC HIF-1α蛋白和 mRNA的表达灰度值(略)

　　与下鼻甲组相比：1)P<0.05

　　3 讨论

　　慢性鼻窦炎、鼻息肉的病因至今仍不清楚。常氧下HIF-1α与von-hippel-lindau 蛋白结合而被修饰,继而被泛肽(Ubiquitin)蛋白酶降解，几乎检测不到HIF-1α蛋白;但在缺氧情况下，HIF-1α降解受阻，在胞内积聚，与HIF-1β形成二聚体，与其要调节的下游基因的低氧反应元素(hypoxic responsive element,HRE)结合，促进缺氧反应基因的转录，引起细胞对缺氧的一系列适应性反应〔4〕。HIF-1α除了在缺氧条件下发挥重要作用，新近研究还发现HIF-1α在炎症中也起到一定的作用。Cramer等〔5〕在骨髓来源细胞系(myeloid cell lineage)中特异性敲除HIF-1α基因，使骨髓来源细胞的移动、趋化、聚集、侵袭性和杀菌力等炎症反应能力均丧失。Walmsley等〔6〕进一步证明鼠和人的中性粒细胞具有的HIF-1α，对其在低氧环境下的存活是必要的，去除HIF-1α的中性粒细胞在缺氧时不能存活。

　　随着人们对上皮细胞研究的不断深入，上皮细胞不再被单纯的认为是一层物理屏障，而是作为一种极其重要的炎症应答的调节者而存在。以往的研究也证实鼻黏膜上皮细胞具有非常活跃的免疫活性〔7〕。LPS是所有革兰阴性菌细胞壁上的主要成分，可导致宿主细胞因子失控性表达，发生严重感染，多脏器损伤等。本实验提示除了缺氧，感染性因子及炎性因子也同样可以诱导HIF-1α的表达。Zarember〔8〕阐明常氧条件下革兰阴性和革兰阳性菌均可以上调HIF-1α在巨噬细胞中的表达，并且Blouin〔9〕曾以LPS成功诱导HIF-1α的表达。LPS可以结合相关细胞表面受体，促进HIF-1α的表达、HIF-1复合物形成，进而激活其靶基因。HIF-1α在鼻息肉中的表达明显高于下鼻甲，说明HIF-1α在鼻息肉的形成中可能起一定作用，感染和炎症都参与了鼻息肉的形成。

　　鼻息肉最重要的组织特征是组织高度水肿，血管内皮生长因子(VEGF)增加血管通透性，导致血浆外渗、细胞外液增多和细胞外基质蓄积，促使组织发生水肿。除VEGF外,目前认为诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在鼻息肉的形成中也起到重要作用，它的大量表达可导致一氧化氮(NO)大量释放。NO是一种重要的炎症介质，可调节各种上呼吸道功能，如血管扩张、血浆外渗、水肿形成。

　　目前研究已经发现,在缺氧及肿瘤发生等病理条件下，机体通过增加HIF-1α的水平来调控红细胞生成素(EPO)、VEGF、iNOS等基因的表达，从而在机体耐受低氧环境及肿瘤的发生和转移过程中起了重要的作用〔10〕。但HIF-1α在慢性鼻窦炎鼻息肉这种炎性环境中的作用机制是怎样的呢? Stefan〔11〕曾阐明HIF-1不仅在缺氧时调节基因转录，在炎症相关的其他信号途径〔如肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1β〕的激活下也可调节许多血管发生相关因子的表达。在缺氧组织中或者在细菌感染后HIF-1α的表达水平增加，与靶基因的HREs相结合调节转录，使得EPO、VEGF、葡萄糖载体蛋白1,3 (glucose transporter 1,3;GLUT1，GLUT3)等表达增加，进而使局部新生血管增多，提高氧的转运。提示在鼻息肉中VEGF、iNOS的表达〔12〕可能与HIF-1α有关，我们认为缺氧、感染、炎症均可能通过激活HIF-1而促进VEGF、iNOS的表达，进而进一步参与鼻息肉的形成。所以HIF-1α促进内皮细胞的增殖，为鼻息肉的生长提供血管供应;诱导局部细胞表达VEGF、iNOS，促进炎症组织区域血管中液体成分和细胞成分通过血管壁进入组织。进而开始上皮破裂，黏膜疝出，再上皮化，新的腺体形成，继而鼻息肉形成，符合了Tos提出的“上皮破裂理论”。所以我们认为在鼻黏膜上皮细胞中HIF-1α首先被激活，进而促进血管相关因子大量表达是鼻息肉发生发展的重要机制之一。

　　一方面，老年人全身及局部的缺氧，导致鼻腔局部HIF-1α的表达增多。缺氧造成的组织损伤还可导致局部炎症反应的发生，促使IL-1β、TNF-α等炎症介质的释放，从而通过增强HIF-1结合相关基因的活性和其他调控途径诱导VEGF、iNOS等的进一步产生。另一方面，鼻腔本身的感染、炎症作用使局部的血流减少，氧耗增多，进而导致局部的缺氧。最终形成恶性循环，感染、炎症、缺氧导致HIF-1α的表达增多，进而促进血管相关因子合成增多导致血管扩张、血浆外渗形成鼻息肉。老年人体质差，并发症多，手术耐受性较差，所以我们更应致力于老年鼻息肉的发病机制研究，进而从预防鼻息肉的发生及药物治疗方向入手治疗老年性鼻窦炎鼻息肉。

　　【参考文献】

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　　2 Zhong H,De Marzo AM,Laughner E,et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases〔J〕. Caner Res，1999;59(22):5830-5.

　　3 Wu R ，Yankaskas J ，Cheng E.Growth and differentiation of human nasal epithelial cells in culture〔J〕.Am Rev Respir Dis,1985;132(2)：311-20.

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　　5 Cramer T,Yamanishi Y,Clauseen BE,et al.HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation〔J〕.Cell，2003;112(5)：645-5.

　　6 Walmsley SR，Print C，Farahi N,et al.Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-κB activity〔J〕.J Exp Med，2005;201(1)：105-15.

　　7 Dong Z，Yang Z，Wang C.Expression of TLR2 and TLR4 messenger RNA in the epithelial cells of the nasal airway〔J〕.Am J Rhinol，2005;19(3):236-9.

　　8 Zarember KA，Maiech HL.HIF-1α:a master regulator of innate host defenses〔J〕?J Clin Investi，2003;115(7):1072-4.

　　9 Blouin CC，Pagé EL,Soucy GM,et al.Hypoxic gene activation by lipopolysaccharide in macrophages：implication of hypoxiainducible factor 1alpha〔J〕.Blood，2004;103(3):1124-30.

　　10 Kuwai T，Kitadai Y，Tanaka S,et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2003;105:176-81.

　　11 Frantz S，Vincent KA，Feron O，et al.Innate immunity and angiogenesis〔J〕.Circ Res，2005;96(1):15-26.

　　12 姜 舒,董 震,朱冬冬,等.缺氧对鼻息肉上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响〔J〕.中华耳鼻咽喉科杂志，2002;37:34-7.