人喉鳞状细胞癌组织中Rac1的表达与肿瘤侵袭转移的关系

　　作者：金宏林 靳红 赵胤 于丹 王海涛 金春顺 作者单位：吉林大学第二医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨Rac-1蛋白与人喉鳞癌临床分期、分化程度及侵袭转移等生物学特性的关系。方法 应用免疫组化SP法对42例喉鳞状细胞癌、42例癌旁组织及10例正常喉黏膜中的Rac-1蛋白进行检测。结果 Rac-1蛋白在人喉鳞状细胞癌组织中的表达明显比正常喉黏膜及癌旁组织高(P<0.01及P<0.05)。Rac1在喉鳞癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、临床分型无关。Rac-1在不同临床分期、分化程度和肿瘤转移的标本中的阳性表达率比较,差异有显著性意义( 均P<0.05)。结论 Rac-1的表达与人喉鳞状细胞癌的临床分期、分化程度及转移密切相关;Rac-1可能在人喉鳞状细胞癌的侵袭转移中起着重要作用。

　　【关键词】 Rac-1;喉鳞状细胞癌;免疫组织化学

　　喉癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一，老化是发生肿瘤的一大危险因素,随着年龄的增长，细胞分裂周期的变化，发生恶性肿瘤的几率逐渐增加。Rac1(Ras相关的C3肉毒素底物1)是Rho家族小G蛋白(Rho-GTPase)的成员之一，参与细胞骨架重组、基因转录调控和细胞信号转导等生理过程〔1〕，从而影响细胞的极性、黏附、生长和运动能力，在肿瘤的发展及侵袭转移等方面发挥重要的作用。已证实该基因与多种肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关，但其在人喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义却鲜有报道。本文采用免疫组化法检测Rac1蛋白在人喉鳞状细胞癌组织中的表达，探讨其与人喉鳞性细胞癌临床分期、分化程度及侵袭转移等生物学特性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料 实验标本取自我科2006年7月至2007年4月喉癌手术切除标本42例，诊断均经组织病理学确定为喉鳞状细胞癌。男29 例，女13 例，年龄43～88岁(平均61.8岁)。术前均未行化疗和放疗。声门上型20例，声门型20例，声门下型2例，按1998 年TNM 分期标准分期，其中Ⅰ期8 例，Ⅱ期14例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。经病理检查证实发生一侧或双侧颈淋巴结转移者12例，无颈淋巴结转移者30例。42例癌旁组织取自距癌组织0.5～1.0 cm。10例正常喉黏膜取自正常喉黏膜。

　　1.2 方法 SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，Rac1鼠抗人单抗为Upstate公司产品。采用链酶素亲和生物素-过氧化物酶法(SP法)进行免疫组化染色。石蜡切片常规脱蜡至水。经3 % H2O2 封闭内源性过氧化物酶及微波加热抗原修复后,滴加非免疫性动物血清室温10 min，之后滴加一抗Rac1抗体(稀释浓度为10 μg/ml)，4℃孵育过夜,然后滴加二抗37 ℃孵育30 min,随后滴加链霉素亲和素过氧化酶溶液37 ℃孵育10 min,最后每张切片滴加新配制的DAB 溶液显色5～10 min。显微镜下观察流水冲洗终止反应,苏木素复染,常规脱水透明封片。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 结果判定 Rac1染色阳性细胞特征为胞浆内出现黄色染色。切片在光镜下观察结果分级：染色强度：无染色为0 分，胞质内见淡黄色颗粒明显高于背景为1分，棕黄色颗粒为2分，深棕黄色颗粒为3 分;阳性百分率(每片随机观察5个视野400×)：计数染色阳性细胞数，阳性细胞数<30%为1 分，30%～75%为2 分，>75%为3 分。染色强度积分+阳性百分率积分得0分为阴性(-)，1～2 分为弱阳性(+)，3～4 分为阳性()，4 分以上为强阳性()。

　　1.4 统计学方法 应用SPSS11.0 完成，率的比较用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 Rac1蛋白在喉鳞癌、癌旁组织及正常喉黏膜中的表达 Rac1蛋白在正常喉黏膜中无表达，在喉鳞癌中染色阳性率为69%(29/42)，显著高于癌旁组织的阳性率12%(5/42)(P<0.01)，喉癌组织与正常喉黏膜比较差异有显著性(P<0.01)。在不同分化程度的喉鳞癌组织中，可见阳性细胞主要是细胞胞浆为淡黄色染色，部分细胞胞膜也呈淡黄色染色，颗粒呈弥漫分布，阳性细胞显色深浅不一，分布不均匀。

　　2.2 Rac1的表达与喉鳞癌临床病理特征的关系 Rac1蛋白在喉鳞癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、临床分型无关。但与组织分化程度、临床分期、有无颈淋巴结转移存在相关性(P<0.05)。随喉鳞癌组织分化程度的降低、临床分期的升高伴有颈淋巴结转移的发生，Rac1蛋白阳性染色率呈逐渐增强的趋势，组间比较有统计学差异(图1，表1)。

　　表1 Rac1与喉癌临床病理特征的关系(略)

　　图1 Rac1在喉鳞状细胞癌中的表达(免疫组化SP×400)(略)

　　3 讨论

　　Rho(Ras homologous)家族的GTPases是公认的调节细胞运动的因子，通过影响细胞的骨架重建、细胞和细胞之间、细胞和基质之间的黏附关系而发挥作用〔2，3〕。Rac1是Rho-GTPase中研究的较多的因子，位于人染色体7p22，它作为分子开关调节细胞信号转导途径，在许多重要的细胞活动中起作用，如参与基因转录、细胞周期过程的调控，并与细胞凋亡、肿瘤侵袭等密切相关〔4，5〕。它通过促进细胞骨架的构建，促进细胞间的黏附以及加强细胞间的信号转导，从而促进细胞增殖。Braga等〔6〕首先证明Rac1 参与调节细胞黏附，他们用微注射方法将显性阴性突变体Rac1Asn17 (将17 位的苏氨酸突变为天冬酰胺,这种突变体可竞争性地抑制GEF 与Rac1 、Cdc42 的作用)注入角质形成细胞,发现内源性Rac1 的活化被抑制,细胞接触中E-钙黏蛋白水平也下降。Rac还可以激活JNK(Jun N-terminal kinase)，激活的JNK可以磷酸化c-Jun 蛋白的转录激活结构域,被磷酸化的c-Jun 形成同源二聚体,并具有AP-1 活性,发挥调节多种基因(包括c-Jun 的基因) 的功能，调节基因转录，同样Rac还可以激活NF-κB及CRE，从而调节细胞的运动和细胞构架〔7〕。Wiggan等〔8〕研究发现，转录因子Pax3诱导MET的过程中需要Rho GTPases激活，黏着斑上有内源性的Pak2、Rac1和PIX(一种Rac/Cdc42-GEF)。可见Rho蛋白在基因转录调控方面也发挥重要的作用。许多研究表明Rac1在人类正常组织中低表达或者不表达，但在多种肿瘤组织及细胞系中高表达，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌，恶性黑色素瘤等〔1，9～12〕，本研究结果与此相符，说明Rac1在喉鳞癌的侵袭转移中发挥作用。吴明富等〔10〕应用免疫组化SP法检测Tiam1和Rac1蛋白在卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织中的表达，发现Tiam1和Rac1蛋白的表达与卵巢癌的临床分期、分化程度及肿瘤转移等密切相关。本文研究也证明这一点，说明Rac1在肿瘤的发生发展过程中发挥作用，与恶性肿瘤的侵袭及转移有关，对其检测有助于喉鳞癌生物学行为的预测和预后的评价。近年来有学者应用RNA干扰等技术构建负显性Rac1，观察Rac1在肿瘤细胞中所发挥的作用。如高广勋等〔13〕通过构建Rac1特异性反义寡核苷酸，然后转染进入HL-60细胞，结果显示Rac1特异性反义寡核苷酸可以明显诱导HL-60细胞凋亡。Xue等〔14〕应用小干扰RNA沉默Rac1的表达，构建重组质粒后转染进入人的胃癌AGS细胞株中，观察重组质粒对细胞的影响，结果显示胃癌AGS细胞株增殖明显受到抑制。这些研究必将对喉癌的生物学治疗起到积极的推动作用。

　　【参考文献】

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　　8 Wiggan O, Shaw AE, Bamburg JR. Essential requirement for Rho family GTPase signaling in Pax3 induced mesenchymal-epithelial transition〔J〕. Cell Signal,2006;18(9):1501-14.

　　9 Fritz G,Brachetti C,Bahlmann F,et al.Rho GTPases in human breast tumours:expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters〔J〕.Br J Cancer,2002;87:635-44.

　　10 吴明富，史艳燕，韩志强，等.人卵巢癌中Tiam1和Rac1的表达与肿瘤侵袭转移的关系〔J〕.中国肿瘤临床,2005;32(16)：910-4.

　　11 朱金明，余佩武，赵永亮.Tiam1和Rac1表达与胃癌病理生物学行为的关系〔J〕.中国普通外科杂志，2005;14(3)：168-72.

　　12 Bauer NN, Chen YW, Samant RS,et al.Rac1 activity regulates proliferation of aggressive metastatic melanoma〔J〕. Exp Cell Res，2007;313(18):3832-9.

　　13 高广勋,陈协群,张永清，等. Rac1在HL -60细胞中的表达及其对细胞周期和凋亡的影响〔J〕.中国实验血液学杂志，2006;14:11-4.

　　14 Xue Y,Bi F,Zhang XY,et al.Inhibition of endothelial cell proliferation by targeting Rac1 GTPase with small interference RNA in tumor cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004;320(4):1309-15.