强力霉素对大鼠颈动脉粥样硬化形成的影响

　　作者：郭原忻，罗俊生，关宁， 霍晓川，李会文 作者单位：辽宁医学院附属第一医院， 辽宁 锦州

　　【摘要】 目的 观察强力霉素对大鼠颈动脉粥样硬化形成的影响及动脉粥样硬化血管壁中相关蛋白的表达，期望为颈动脉粥样硬化形成提供新的预防和治疗线索。方法 应用球囊损伤联合高脂饮食灌胃加VD腹腔注射方法建立大鼠颈动脉粥样硬化模型，给予强力霉素，观察其对动脉粥样硬化形成的影响及MMP-2、MMP-9的表达。结果 MMP-2、MMP-9在动脉粥样硬化模型血管壁呈高表达，可使基质金属蛋白酶表达下降。结论 基质金属蛋白酶的表达同动脉粥样硬化形成密切相关，抑制其表达可抑制动脉粥样硬化形成。

　　【关键词】 动脉粥样硬化;强力霉素;基质金属蛋白酶

　　Doxycycline Inhibits the Formation of AtherosclerosisGUO Yuanxin， LUO Junsheng， GUAN Ning， HUO Xiaochuan， LI Huiwen

　　(The Fist Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective To explore the effect of doxycycline on the formation of AS and the expression of AS relative proteins, with the expection to find a new prophylaxis and therapy clue to the formation of carotid Atherosclerosis. Methods To establish Carotid atherosclerotic rat model by using vitamin D and fat diet after balloon injury. Doxycycline was applied, observing its influence on the formation of atherosclerosis and the expression of MMPs. Results Doxycycline could inhibit MMPs expression in carotid artery wall of AS. Conclusions MMP-2 and MMP-9 were in close relationship with the formation of AS. Non-specific down-regulation of MMPs expression could inhibit the formation of AS.

　　Key words：atherosclerosis(AS); doxycycline; matrix metalloproteinase(MMP)

　　颈动脉粥样硬化的防治是神经外科学领域内的热点课题。近年的研究表明，MMPs活性升高、细胞外基质的生成或降解失衡是动脉粥样硬化形成过程中十分重要的环节。四环素族抗生素具有潜在的抑制MMPs的作用，其中强力霉素已经作为MMPs抑制剂在牙周疾病中应用[1]。本研究使用球囊损伤联合高脂饮食灌胃加VD腹腔注射方法建立大鼠颈动脉粥样硬化模型，进一步给予强力霉素，观察其对大鼠颈动脉粥样硬化形成的作用，期望为颈动脉粥样硬化形成提供新的预防和治疗线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性健康SD大鼠30 只，体重(200±10) g，购自辽宁医学院实验动物中心。

　　1.1.2 主要试剂

　　强力霉素粉剂由上海五洲药业公司提供， 2F球囊导管购于美国Cordis公司，胆固醇、胆酸钠购于德国Serva公司，丙基硫氧嘧啶、VD注射液购于苏州第二制药厂。兔抗大鼠MMP-2抗体、兔抗大鼠MMP-9抗体及SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验动物分组和饲养

　　随机将实验动物分为3组。

　　(1)模型组：n=10，造模术后给予高脂饮食腹腔注射VD3，并且灌胃给予等量的生理盐水，时间同上。

　　(2)强力霉素组：n=10，造模术后给予高脂饮食腹腔注射VD3，同时从造模术后第1天开始灌胃给予强力霉素(4 mL/kg)，直至取材。

　　(3)空白对照组：n=10，正常SD大鼠灌胃给予等量的生理盐水。

　　给药方式：将强力霉素配制成浓度为0.75%的药液，按4 mL/kg，1 次/d,直接灌胃给药。

　　分别于实验前、实验8 w禁食过夜，鼠尾采血，分离血清，采用全自动生化分析仪测定血脂四项。以上3组大鼠在喂养8 w后心脏灌注固定取材。

　　1.2.2 动物模型的制备

　　10%水合氯醛麻醉大鼠，固定动物，取颈部正中切口，游离出颈内动脉与颈外动脉分叉部，用血管夹临时夹闭颈总动脉近心端、颈内动脉近心端，以阻断血流，经过颈外动脉远心端枕动脉分支处剪开一个“V”字形切口,从切口处向颈总动脉方向插入球囊导管至颈总动脉临时结扎处。充气约0.10～0.15 mL,可以明显看到颈总动脉被扩张膨大，旋转拖出球囊后再次插入，反复进行3 次，以损伤血管内膜。

　　1.2.3 指标检测

　　(1)测定血脂四项。

　　(2)动脉斑块的检测 用CIAS-1000型细胞图像分析系统进行图像分析，分别测出动脉内膜厚度、内膜面积。通过内膜厚度、内膜面积，来评价动脉粥样硬化的严重程度。

　　(3)免疫组化法 对MMP-2、MMP-9进行定性和半定量分析。

　　1.2.4 统计学分析

　　所有数据以(x±s)表示，采用SPSS12.0软件，首先进行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析进行比较分析，P<0.05为有统计学意义;P<0.01为有显著差异。

　　2 结 果

　　2.1 血脂

　　高脂饲养8 w后，模型组和强力霉素组TG、TC及LDLC较空白对照组均显著升高(P<0.01),HDLC则下降(P<0.05)，并且未发现强力霉素干预对血脂水平产生影响(P>0.05)，见表1。 表1 强力霉素对大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和高密度、低密度脂蛋白胆固醇的影响注:*为与空白对照组比较，P<0.01;▲为与模型组比较，P>0.05。TC：总胆固醇; TG：甘油三酯; LDLC：低密度脂蛋白胆固醇; HDLC：高密度脂蛋白胆固醇

　　2.2 动脉斑块的检测

　　HE染色病理切片的镜下观察发现，与空白对照组比较，强力霉素组和模型组均可见动脉内膜明显增厚，内弹力纤维薄膜降解和内膜炎症细胞浸润，并有大量单核吞噬细胞和泡沫细胞聚集，大量中层平滑肌细胞向内膜转移,见图1，2，3。模型组和强力霉素组动脉内膜厚度与内膜面积与空白对照组比较差异有显著性(P<0.01，见表2);强力霉素组与模型组内膜厚度与内膜面积差异有显著性(P<0.01，见表2)。表2 强力霉素对高脂饮食大鼠血管内膜增生的影响组 别n内膜厚度(μm)内膜面积空白对照组注:*为与空白对照组比较，P<0.01;▲为与模型组比较，P<0.01

　　2.3 免疫组化法测定

　　空白对照组未见MMP-2、MMP-9的表达。模型组和强力霉素组的MMP-2、MMP-9的表达呈阳性反应，表现为动脉组织内有MMP-2、MMP-9棕褐色颗粒沉积，模型组表达较强力霉素组明显增加。用阳性细胞的平均灰度值代表该切片中阳性细胞中MMP-2、MMP-9的含量，灰度值经方差分析可以看出：强力霉素组和模型组的MMP-2和MMP-9的表达均增强，强力霉素组的表达较模型组弱，详见表3、 图4-5。表3 MMP-2、MMP-9表达的灰度值组别nMMP-2MMP-9空白对照组注:▲为与模型组比较，P<0.05

　　3 讨 论

　　动脉粥样硬化的形成是一个十分复杂的过程，目前大量研究结果已证实细胞外基质(ECM)合成或降解失衡是动脉粥样硬化形成过程中十分重要的环节，基质金属蛋白酶(MMPs)是调节ECM最重要的酶类，与动脉粥样硬化的形成密切相关，动脉粥样硬化斑块的MMPs表达增加，ECM降解增多。目前认为MMPs是ECM转化所需的主要物质，可以高效降解基底膜的主要成分——Ⅳ型胶原，在粥样病变形成的过程中起关键作用。由于细胞增殖和ECM沉积与由MMPs所引起的基质降解之间失去平衡，最终导致斑块形成。斑块内MMPs活性增高，降解ECM，使纤维帽变薄，形成不稳定斑块。不稳定斑块受到血流冲击时极易形成脱落栓子，进而导致脑栓塞。因此，鉴于MMPs的表达与斑块不稳定性的关系，有望以MMPs为治疗靶点，稳定斑块从而预防脑栓塞的发生。由本实验可知，在动脉粥样硬化形成过程中血脂明显升高，经过造模大鼠颈动脉形成了粥样硬化病变，并且MMP-2、MMP-9活性和表达明显增高，而通过强力霉素抑制MMP-2、MMP-9的活性和表达，动脉粥样硬化的程度明显减轻。由此可知，基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化斑块形成过程中具有重要的作用。

　　四环素族抗生素是通过抑制细菌蛋白合成达到抑菌作用的，但近期的研究发现它还是一种潜在的MMPs抑制剂。强力霉素就是其中一种化学修饰的四环素类药物，具有价格低廉、毒性小，可以长期服用的优点，四环素族抗生素因其抗MMPs活性已被用来减少主动脉瘤[2]、牙周疾病[3]、关节炎[4]等疾病的组织分解，以及肿瘤细胞的浸润、转移[5]及肿瘤的血管生成。在美国强力霉素已经得到批准作为非特异性MMPs抑制剂在牙周疾病中应用[6]。由于MMPs在各种心血管疾病的发生和发展中起着重要作用，近来有人研究用此药物防治动脉硬化、血管再狭窄等疾病。

　　本研究发现，通过高脂喂养促进大鼠形成高脂血症的方法可以成功构建大鼠颈动脉粥样硬化模型，而经过强力霉素干预后大鼠颈动脉粥样硬化组织中MMP-2、MMP-9活性和表达均明显减低。MMPs合成和活性降低的结果与强力霉素治疗大鼠腹主动脉瘤[7]及人主动脉瘤修补术前的组织标本结果一致[8]。形态学及免疫组化结果表明强力霉素可以通过减少血管壁内膜增厚的程度，减少血管管腔面积的损失。以上结果提示作为MMPs抑制剂的强力霉素可能具有防治动脉粥样硬化形成的作用。

　　【参考文献】

　　[1] Brinckerhoff CE, Matrisian LM.Matrix metalloproteinases：a tail of a frog that be-came a prince[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3：207-214.

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　　[3] Schwartz Z, Lohmann CH, Wieland M, et al. Osteoblast proliferation and differentiation on dentin slices are modulated by pretreatment of the surface with tetracycline or osteoclasts[J]. J Periodontol, 2000, 71 (4) : 586 - 597.

　　[4] Greenwald RA, Golub LM, Ramamurthy NS, et al. In vitro sensitivity of the three mammalian collagtenases to tetracyclines inhibition: relationship to bone and cartilage degradation[J]. Bone, 1998, 22 (1) : 33 - 38.

　　[5] 高晓康, 王禾,武国军,等. 强力霉素抑制前列腺癌PC-3细胞的体外侵袭作用[J]. 第四军医大学学报, 2002, 23 (24) : 2261-2264.

　　[6] Wynn RL. Latest FDA approvals for dentistry [J]. GenDent, 1999, 47 (1) : 19-22.

　　[7] Curci JA, Petrinec D, L iao S, et al. Pharmacologic suppression of experimental abdominal aortic aneurysms: a comparison of doxycycline and four chemically modified tetracyclines [J]. J Vasc Surg, 1998, 28 (6) : 1082 -1093.

　　[8] Curci JA, Mao D, Bohner DG, et al. Preoperative treatment with doxycycline reduces aortic wall exp- ression and activation of matrix metalloproteinases in patients with abdominal aortic aneurysms [J]. J Vasc Surg, 2000, 31(2) : 325 - 342.