甲状腺乳头状癌基因谱表达的初步研究

　　作者：刘伟松,项丞,田冶 作者单位：1.农垦总局医院头颈颌面外科,海南 海口 570311;2.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院头颈外科,黑龙江 哈尔滨 150081;3.海南医学院预防系统计教研室,海南 海口 571101

　　【摘要】目的：利用基因芯片筛选与甲状腺乳头状癌发生、发展和与恶性度相关的基因。方法：分别选取高、低分化甲状腺乳头状癌组织标本，抽提、纯化mRNA，同法再纯化同患者的正常甲状腺组织的mRNA;用Cy5荧光染料对甲状腺乳头状癌组织mRNA作探针标记，以Cy3荧光染料对正常黏膜组织的mRNA作探针标记，一同和可检测4 096个基因片段的BiostarH40 s型基因芯片进行杂交得到的双色荧光标记芯片，将之分别扫描入计算机，进行结果分析。结果：高、低分化2种芯片上均有大量基因片段出现了的高/低表达的情况，高分化芯片上异常表达片段数量为低表达351条，高表达417条，低分化芯片上异常表达者为低表达410条，高表达415条。在2种芯片中均有相同表达差异趋势的基因片段中，共计有90条基因片段出现低表达，其中随恶性度增高而降低的基因有19条;有78条片段呈现高表达状态，其中随恶性度增高而表达增加的有25条。表达异常的片段功能较分散;有大量的不明功能的片段发现。结论：甲状腺乳头状癌的发生、发展不能用单一的基因变异解释，而是由多基因共同作用的结果，并且变异具有明显的个体性差异;甲状腺乳头状癌的恶性度与多个基因片段异常表达相关。很多新发现的片段的功能不明了，对于确定甲状腺乳头状癌的发生发展内在机制仍有待研究。

　　【关键词】 基因芯片;基因表达;甲状腺癌

　　Study on genes expression of papillary thyroid carcinoma by cDNA microarrays

　　LIU Weisong, XIANG Cheng, TIAN Ye

　　1. Head, Neck Oral and Maxillofacial Surgery, Hainan Land Reclamation Bureau Hospital Haikou 570311; 2.Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Harbin Medical University Harbin 150081; 3.Teaching and Research Division of Statistics, Department of Prevention Medicine, Hainan Medical University Haikou 571101, China

　　[ABSTRACT]Objective: To screen genes that were correlative with carcinogenesis, development and malignance of papillary thyroid carcinoma using cDNA microarray. Method: Two pieces of papillary thyroid carcinoma tissue with different malignance degree and samples from normal thyroid tissue were collected for mRNA extraction and purification. Marked the purified mRNA from carcinoma tissue with Cy5 deoxycytidine triphosphate for probes labeling and mRNA from normal tissue with Cy3dCTP separately, mix these two kinds of mRNA probes together and then hybridize to the cDNA microarray. If Cy3 signal is stronger, the spot on the microarray would be green, means lowexpressed gene. While stronger Cy5 signal will lead to a red spot, which means overexpressed gene. Experiment gets 2 pieces of doublecolor cDNA microarrays and then they were scanned into computer and analyzed. Result: Differences were found between carcinoma tissue and normal thyoid tissue in their gene fragments' expression. In the welldifferentiated chip, there are 351 lowexpressed and 417 overexpressed gene fragments presented. To the poorly differentiated chip, the correspondence number was 410 and 415. 90 lowexpressed and 78 overexpressed genes fragments were individually presented in both chip segments with similar expression trend, of which, expression of 25 seemed correlated to malignant degree. Large quantity of genes with unknown functions were found. Conclusion: The carcinogenesis, development and malignance degree of papillary thyroid carcinoma is resulted from different kinds of abnormality of polygenes not a single gene. Since functions of many gene fragments has been unknown to us yet, further study still needs to be done.

　　[KEY WORDS] Gene chip; Gene expression; Thyroid carcinoma

　　甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，病理分型上分为4种：乳头状癌、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌，其中又以乳头状癌(papillary thyroid carcinoma， PTC)所占比例最大，约为70%左右，故而获得了更多的研究关注。在以往的文献中，对于乳头状癌异常基因片段表达情况的研究多为某一片段，难于产生较为全面的认识。本实验即利用基因芯片对甲状腺乳头状癌的基因进行大规模片段的研究，对其基因谱表达作一初步分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本制备

　　所有病例均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院。术前选择单侧甲状腺发生肿瘤病例，手术中切取肿瘤组织和对侧腺体正常组织，分别进行液氮冷冻保存。术后根据病理诊断，确定为单侧甲状腺乳头状癌者标本留用，否则筛除。最终样本皆为女性。

　　1.1.2 基因芯片

　　上海博星公司产BiostarH40 s基因芯片。

　　1.1.3 实验试剂

　　均由上海博星公司对外试验室提供，包括TRIzol，异丙醇,氯仿，RNeasy Midi kit 75142，Easy Exteact，75%乙醇(RNasefree)，MilliQ水(RNasefree)，无水乙醇,杂交试剂盒等。其中TRIzol购自LifeTechnologies公司，试剂盒中RNAlater，DEPC，RNAsecure TM Reagent购自Qiagen公司。

　　1.1.4 仪器与设备

　　S200纯化柱购自Amersham Pharmacia Biotech Inc，CT0250型真空浓缩仪购自CHRIST Ltd.，GenePix 4 000B型芯片扫描仪购自AXON Ltd，核酸分析仪产自Biochrom Ltd. Cambridge CB4 OFJ England，MilliQ水生成仪购自MILIPORE Ltd.，DY891型电动玻璃匀浆机产自宁波新芝科器研究所，FR280型电泳仪和FR200型凝胶成像仪产自上海复日科技，QL901型漩涡混合器购自海门市麒麟医用仪器厂，DND9052型杂交箱产自上海精宏实验设备有限公司。

　　1.1.5 计算机处理软件

　　采用GenePix Pro 3.0计算机处理软件

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织标本的获取

　　手术中甲状腺肿瘤标本切下后，立即切取肿瘤组织和对侧腺体组织标本，分别置入冷冻管中，标明实验组和对照组编号，迅速投入液氮容器冷却，整个过程在3 min内完成。术后对肿瘤组织和对侧腺体组织作病理以明确病理性质。留用标准为：单侧乳头状癌，对侧组织为正常腺体、组织切片内未见微转移灶或其他良性病变。

　　1.2.2 分组

　　按照分化程度，将高分化、低分化乳头状癌分别进行试验。

　　1.2.3 总RNA提取

　　将超低温保存的样品称重、碾磨、匀浆、多次离心得到RNA 沉淀后，加入RNasefree 的MilliQ水溶解，保存。

　　1.2.4 探针标记与杂交

　　预杂交、在冰浴中进行探针标记(对癌组织用Cy5荧光染料作标记，作对照的同患者的对侧正常甲状腺组织则以Cy3荧光染料作标记)、杂交、洗片,芯片晾干后扫描入计算机。

　　1.2.5 计算机处理

　　将扫描结果进行计算机处理，测定基因变化情况。

　　2 结果

　　2.1 总RNA检验结果

　　两组样本的mRNA质量及数量经检测全部合格，符合实验要求。

　　2.2 基因芯片的原始情况

　　基因芯片的荧光标记图像(图1)叠加，扫描入计算机后，进行分析处理。基因片段表达高低的判定方法为：以Y轴表示Cy5 荧光的杂交信号相对强度,X轴示Cy3 的杂交信号强度，作图(图2)，每一个数据点代表芯片上1个基因点的杂交信号。结果可见大部分基因信号位于45 度线附近，Cy5/Cy3的比值在0.5～2.0之间，在此范围基本属于非差异性表达;远离45度角直线的点(Cy5/Cy3的比值在0.5～2.0范围之外) 则提示基因片段存在差异性表达，低于0.5者为低表达，高于2.0为高表达。

　　2.3 表达差异基因分类结果

　　高、低分化两种芯片上均有大量基因片段出现了的高/低表达的情况，高分化芯片上异常表达片段数量为低表达351条，高表达417条，低分化芯片上异常表达者为低表达410条，高表达415条。在2种芯片中均有相同表达差异趋势的基因片段中，共计有90条基因片段出现低表达，占基因检测总数的2.20%，其中随恶性度增高而降低的基因有19条;有78条片段呈现高表达状态，占总数的1.90%，其中随恶性度增高而表达增加的有25条。表1中列出了2张芯片中Cy5/Cy3值超过8的片段。表1 低、高分化甲状腺乳头状癌最高表达基因片段对照简表(略)

　　3 讨论

　　甲状腺癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，甲状腺恶性肿瘤中PTC最常见。国际上公认PTC的病理诊断标准为细胞核呈毛玻璃样伴有核沟及核内包涵体[1]。但恶性肿瘤具有异质性，有些PTC并不具有上述特征，一些良性甲状腺病变也有类毛玻璃样核。在活检及细针吸取甲状腺标本中，一些PTC单凭HE染色，镜下难以与良性病变区别，易造成误诊和漏诊，延误病情，临床实际工作中需要新的可靠的标记物协助PTC诊断鉴别。明确甲状腺乳头状癌的基因谱变化对明确甲状腺乳头状癌的分子生物学发生、临床快速诊断以及将来的个性化基因治疗都有意义。

　　基因芯片杂交技术是近几年新发展的具有突破性的基因水平检测技术，实验方法简便，结果准确，具有高通量、高特异性的特点[2]，可以同时检测几千乃至上万基因片段的表达情况，最适合于肿瘤基因的大规模分析[3]。本次实验所用基因芯片为包含有16类共4 096个基因探针，可检测的基因片段有原癌基因和抑癌基因、离子通道和运输蛋白、细胞周期蛋白类、外压反应蛋白、细胞骨架和运动、细胞凋亡相关的蛋白等15类已知的及若干功能尚未明了的未知片段。

　　在2种芯片中，各自有约20%左右的片段发生异常表达，由此可见，发生变异的甲状腺癌基因片段是多量存在的，并非只是个别片段。比照差异片段，只有总计约4.1%的片段在高低表达的芯片上都有相同的异常表达趋势，并且其中一些片段尚和恶性度的高低有着相关性。由此说明，PTC尽管在光镜下有着类似的表现，但是在基因水平上，个体差异是巨大的，并且差异最大的片段并非完全吻合，也正是因为这个原因，说明PTC患者对相同化疗方案的敏感度必然不同。对于今后的拟行化疗的PTC患者，使用基因芯片进行相应的药物敏感度筛查是治疗前一项必要步骤。对于表达趋势相同的片段而言，很可能是造成PTC最终表达的根本所在，追寻肿瘤发生发展的原因，这些共性表达的片段是今后重点研究的对象。

　　在最高表达片段中，如BF698911、NM_003385、BX537530、BF698898等，集中隶属于细胞信号和传递蛋白片段、蛋白翻译合成类片段。另外，在全部的异常表达片段中，细胞信号和传递蛋白片段、其它未知片段所占比例最大。可见信号系统及蛋白质合成的异常很可能是PTC发生、发展的关键。对于以上4个片段，有必要进行进一步的研究以明了其在TPC中的具体作用。

　　在PTC，目前手术仍然是治疗的主要方法，但是对于一些主观上排斥手术或客观上不宜进行手术的患者，却仍然欠缺理想的非手术治疗手段[4]。恶性肿瘤的治疗方法在当代已经有了比较大的发展，除了传统的三大治疗方法，一些新型的治疗方法日益显示出旺盛的生命力，生物学治疗已经成为公认的肿瘤第四疗法，如白介素应用于某些肿瘤的治疗，已取得了显著效果。基因治疗属于生物学治疗的一种，是一种非常有发展前景的方法。肿瘤是基因病，理论上有个性化的基因治疗是最理想的措施。针对性的基因治疗有可能使以手术和131I放疗为主的治疗方式[1,5]发生根本性的变化，但前提是明确肿瘤基因谱的变化，对症下药。在共同高表达最明显的片段中，功能已知的为NM_000584，即白介素8的mRNA，白介素家族或许是可以达到一定治疗效果的突破口。

　　在本次试验中，同样可以发现基因芯片在当前临床应用仍然有一些局限性。如单张芯片造价较高、相应的试验需要配套的设备、灵敏度较高易出现假阳性等。在大样本的对照试验未果之前，目前似乎尚不能单纯依靠基因芯片进行PTC的临床诊断。但是，对于其远期的个性化生物治疗、抗癌药物敏感性的判断等方面，有着良好的应用前景。对于此次试验得到的异常表达片段，将是进一步研究的目标。

　　【参考文献】

　　1 马茂，王治伦. 分化性甲状腺癌的诊断和外科治疗[J]. 中国地方病学杂志，2002,21(1):1920.

　　2 Hartmann KA, Modilich O, Prisack HB. Gene expression profiling of advanced head and neck squamous cell carcinoma and two squamous cell carcinoma cell lines under radio/ chemotherapy using cDNA arrays [J]. Radiother Oncol,2002,63(3):309320.

　　3 Sok JC, Kuriakose MA, Mahajan VB. Tissue specific gene expression of head and neck squamous cell carcinoma in vivo by complementary DNA microarray analysis[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2003,129(7):760770.

　　4 石磊,陈平,何春兰,等.分化型甲状腺癌初次手术方式的探讨(附103例分析)[J].实用临床医药杂志,2008,12(12):5253.

　　5 陈林 陈昕 云惟康. 甲状腺癌术后放射疗法效果分析[J]. 中国地方病学杂志，2007,26(3):336.