脑胶质瘤浸润淋巴细胞抗原受体基因限制性取用

作者：康德智,连葆强,林元相

作者单位：福建医科大学附属第一医院神经外科，福州 350005

      【摘要】  目的 检测人脑胶质瘤中肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是否存在抗原受体基因的限制性取用及其类型，探讨其免疫学和临床意义。 方法 术中取人脑胶质瘤组织，分离TIL，用RT-PCR方法检测其TCR Vα7和TCR Vβ各基因片断的表达。 结果 13例TIL中，TCR Vα和TCR Vβ各基因片断的表达率以Vα7（6/10）、Vα12（4/10）、Vα13（3/10）高于其他亚型，Vβ14（6/10）、Vβ13.1（3/10）、Vβ8（3/10）高于其他Vβ亚型，其中以Vα7、Vβ14的表达最高，且二者量同步表达。 结论 人脑胶质瘤TIL存在着抗原受体基因Vα7、Vβ14的优势取用，表达这一TCR亚型的TIL可能是局部抗肿瘤反应的主要效应细胞。

【关键词】  神经胶质瘤;淋巴细胞，肿瘤浸润;受体，抗原，T细胞;基因

　胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，占脑肿瘤的40%以上;手术复发率高，生存期短，预后差，严重威胁人类的健康。胶质瘤的免疫治疗作为手术、放疗和化疗的辅助治疗方法日益受到人们的重视。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继治疗已被证明是治疗肿瘤的有效手段［1-2］ 。TIL中选择性表达某一TCR基因的T细胞亚群，可能就是抗肿瘤的主要效应细胞亚群。为此，笔者应用RT-PCR方法检测了脑胶质瘤TIL中TCR基因的表达。     　　1 材料与方法     　　1.1 材料 TRIZOL及One-step RT-PCR试剂盒（美国Invitrogen life technologies公司）。RPMI1640（Gibico公司），新生牛血清购自（杭州四季青生物工程材料有限公司），胶原酶、淋巴细胞分离液、胰蛋白酶（上海生工生物工程服务有限公司）。    　　1.2 标本 随机选取13例原发胶质瘤患者的肿瘤组织。患者男性9例，女性4例，年龄（46±4.6）岁（38～65岁）。手术前均未采取放疗、化疗等。无其他慢性疾病史。术后的病理检查证实为胶质瘤，其中Ⅱ～Ⅲ级8例，Ⅲ级2例，Ⅳ级3例。    　　1.3 TIL分离与培养 取手术切除的新鲜肿瘤组织，无菌生理盐水冲洗干净，剔除脂肪组织。肿瘤组织置于盛有Hank's液的无菌培养皿中，剪碎。在剪碎的组织块内加入终浓度为0.1%胶原酶4℃消化24h。消化后的悬液以200目铜网过滤，收集滤过的细胞悬液。细胞悬液以500r/min离心10min，弃上清。Hank's液混悬后，进行不连续密度离心。试管内加入100%淋巴细胞分离液（相对密度1.077）3mL，再缓慢加入75%淋巴细胞分离液1.5mL，最后在上层缓慢铺入细胞悬液。置于水平离心机，2500r/min，离心20min。收集两层分离液检的细胞悬液。

　　1.4 RNA提取 TRIzol试剂提取TIL的总RNA。分离的TIL加入TRIzol1mL溶解，再加入氯仿0.2mL，12000r/min离心15min。吸取上层水相，加异丙醇0.5mL，12000r/min离心10min，去上清，75%乙醇洗涤，溶解于无RNA酶的水30μL，用紫外分光光度计检测RNA溶液在260nm和280nm的光密度（D），D260nm /D 280nm 在1.8～2.0。    　　1.5 RT-PCR 引物由上海博亚生物有限公司合成。序列及片段长度见表1，2。一步法参照说明书进行，50μL反应体系中含有2×Mixbuffer25μL，     　　表1  TCR Vα链引物序列（略）

　　表2 TCR Vβ链引物序列（略）     　　模板1μg，引物各10pmol，AMV，RT酶/Taq酶1μL（2.5U），用无RNA酶的水补至50μL。反应条件为:逆转录55℃30min，94℃2min;PCR参数94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环;最后一个循环72℃7min。整个反应在DNA扩增仪上（GenAmp PCR system9600）进行。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，于凝胶分析系统中观察。扩增片段的大小约为400～520bp。

　2 结果     　　13例新鲜人脑胶质瘤组织中，10例分离出可供研究的TIL。应用RT-PCR方法对10例脑胶质瘤TIL表达的TCR基因进行检测。在TCR Vα的检测中，Vα7、Vα12、Vα13的表达明显高于其他TCR Vα亚型的表达。对TCR Vβ的检测，Vβ14、Vβ13.1、Vβ8　的表达也高于其他TCR Vβ亚型的表达（表3）。其中以Vα7（图1），Vβ14（图2）的表达最高，且二者呈共同表达。TCR表达谱呈现明显的偏移现象。     　　表3  人脑胶质瘤中TCR Vα、TCR Vβ表达（略）          M:Marker;1-10:不同标本的TIL（下图同）.

　　图1  人脑胶质瘤TCR Vα7表达（略）     　　图2  人脑胶质瘤TCR Vβ14表达（略）     　　3 讨论     　　TCR是一个由α、β链组成的异二聚体。编码多条链的基因由相互分离的V、（D）、J基因片断组成，经过这些基因片断的重排，才能形成有功能的TCR分子。TIL可通过各种不同的重排方式产生极其多样的TCR结构。一些自身免疫性疾病如风湿性关节炎、实验性变态反应性脑炎，以及同种异体移植后分离出的T淋巴细胞均出现TCR Vα或Vβ基因的优势重排，即限制性取用现象，而表现为某些TCR谱的偏移。机体的抗肿瘤反应主要通过细胞免疫得以实现。尽管肿瘤组织内有淋巴细胞浸润，但并非所有浸润的淋巴细胞均是抗肿瘤效应细胞。从黑色素瘤组织分离出的自体肿瘤特异的细胞毒性T细胞表现为寡克隆。这些现象提示，在自身免疫或抗肿瘤免疫反应中起主要作用的可能是异质性T细胞中的某些亚群，它们特异地针对相应的抗原［3-4］ 。当这些抗原肽与MHC结合表达在APC细胞或靶细胞表面上，T细胞要对它进行识别就必须有相应的TCR，这必须通过TCR基因的限制性取用来实现［5-6］ 。    　　笔者的研究显示，在人脑胶质瘤TIL中存在着TCR基因限制性取用现象，表现为Vα7和Vβ14的优势同步表达。而Ebato等观测到Vα7和Vβ14非同步优势表达，但鉴于在外周血淋巴细胞（PBL）中也对应存在Vβ13.1的高表达，因此认为表达Vα7的TIL亚群是胶质瘤抗原的靶向特异性T细胞亚群［5］ 。本研究与Ebato观测结果的部分差异可能与TIL来源胶质瘤级别不同有一定关系，本研究的TIL主要来自Ⅱ～Ⅲ级胶质瘤组织，而Ebato等观测的TIL来自Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织。尽管结果有些差别，但有一点是一致和明确的，那就是Vα7TIL是通过主动的选择性累聚而产生，并不是通过外周血相应的T细胞被动或随机浸润到瘤内而产生。这些细胞在肿瘤局部都会发生寡克隆增殖，并在抗胶质瘤免疫反应中起重要作用。至于Vβ14的作用有待同时检测PBL Vβ14的表达结果方可明确判断（Ebato等的资料显示PBL Vβ14有较高表达）。    　　本研究所显示的TCR基因限制性取用现象提示，今后可利用相关的TCR基因作为探针分析寻找胶质瘤抗原。此外，可在体外克隆扩增Vα7TIL用于人脑胶质瘤过继免疫治疗，有望提高免疫治疗效果。既往的研究已表明，胶质瘤局部TIL存在与否与患者预后有一定关系。若进一步检测胶质瘤TIL中 Vα7TIL的数量和活性，可能更有助于判断患者的预后转归，成为一项有价值的预后判断指标。这有待于今后深入研究。

【参考文献】  　［1］ 康德智，张国安，刘小朋，等.胸腺因子D/重组白细胞介素2高效诱导人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的增殖杀伤活性［J］. 福建医科大学学报 ，2000，34（1）:18-20.

　　［2］ Hayes RL，Arbit E，Odaimi M，et al.Adoptive cellular im-munotherapy for the treatment of malignant gliomas［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2001，39（1-2）:31-42.

［3］ Parish CR.Cancer immunotherapy:the past，the present and the future［J］.Immunol Cell Biol，2003，81（2）:106-113.

　　［4］ Perrin G，Schnuriger V，Quiquerez AL，et al.Astrocytoma in-filtrating lymphocytes include major T cell clonal expansions confined to the CD8subset［J］.Int Immunol，1999，11（8）:1337-1350.

　　［5］ Ebato M，Nitta T，Yagita H，et al.Shared amino acid se-quences in the ND beta N and N alpha regions of the T cell re-ceptors of tumor-infiltrating lymphocytes within malignant glioma［J］.Eur J Immunol，1994，24（12）:2987-2992.

　　［6］ Dietrich PY，Walker PR，Schnuriger V，etal.TCR analysis re-veals significant repertoire selection during in vitro lymphocyte culture［J］.Int Immunol，1997，9（8）:1073-1083.