莪术油对鼻咽癌CNE2细胞的凋亡及放疗增敏机制的影响

　　作者：吴冬梅，杨荣宁 作者单位：530021 南宁，广西医科大学附属肿瘤医院头颈外科

　　【摘要】 目的 探讨莪术油、莪术油联合γ射线照射对鼻咽低分化鳞癌细胞株CNE2的增殖抑制和诱导凋亡作用;分析莪术油是否具有放疗增敏的作用，并研究其机制。方法 体外培养CNE2细胞，莪术油以体外直接加药的方式作用于CNE2细胞，采用MTT、流式细胞术、电镜等分子生物学手段，检测莪术油单用或联合γ射线对CNE2的诱导凋亡作用、放疗增敏作用。结果 莪术油单独使用，对CNE2细胞有确切的增殖抑制及诱导凋亡作用，并与常规化疗药物5Fu有相近的抑制作用(P>0.05)。莪术油的药物抑制作用呈现浓度依赖性，最低起效浓度为10μg/ml，最佳作用时间为48小时; 5μg/ml、100μg/ml、300μg/ml的莪术油联合100cGy的γ射线作用2天后凋亡率由0.5%、2.15%、10.2%显著提高到8.6%、14%和26%，细胞的死亡率均在5%以下有明显的协同增效作用(P<0.01);联合作用96h后试验组的细胞主要以死亡为主，凋亡较少;500μg/ml的莪术油主要导致细胞死亡，有明显的细胞毒性。流式细胞仪结果显示较高浓度时，莪术油使CNE2细胞阻滞在G1期。电子显微镜观察细胞凋亡的超微结构可以看到凋亡小体。结论 莪术油可以抑制鼻咽癌细胞CNE2的增殖并诱导其凋亡;莪术油和100cGy的γ射线联合作用有明显的增敏作用;其作用机制与诱导肿瘤细胞发生凋亡及影响细胞生长周期有关。

　　【关键词】 鼻咽癌;CNE2;莪术油;γ射线;放疗增敏

　　Effect of Zedoary Oil for Apoptosis and Radiotherapy in Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE2

　　WU Dongmei,YANG Rongning

　　Department of Head and Neck Surgery,Cancer Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

　　Correspondling Author:YANG RongningAbstract：Objective To explore the Zedoary oil,Zedoary oil joint γray irradiation on human nasopharyngeal carcinoma (NPC)cell lines CNE2 inhibiting the proliferation and induction of apoptosis; analysis of whether the Zedoary oil enhancement of the role of radiotherapy.Methods MTT colorimetric assay and electronic microscope method were employed to examine the growth status and apoptosis of CNE2 cells.Flow cytometry was employed to detect the effect of Zedoary oil、Zedoary oil and/or γradiation for growth inhibition in CNE2 cells.Results Zedoary oil used alone,the CNE2 cell proliferation is the exact effect,and all with conventional chemotherapy drug 5Fu a similar effect (P>0.05) ;Zedoary oil drugs inhibit a concentrationdependent,the minimum effect from the concentration of 10μg/ml,the best time of 48 hours; flow cytometry showed that 10μg/ml, 100μg/ml,300μg/ml Zedoary oiltreated CNE2 cells the apoptosis ratio of were 0.5%,2.15%,10.2% on 48 hours,respectively.In the group of treatment with 10μg/ml,100μg/ml,300μg/ml curcuma and 100cGy γradiation,the apoptosis ratio were 8.6%,14%,26% on 48 hours,respectively.And the average mortality rate of cells were below 5.0%.They has the synergistic action for apoptosis in CNE2 cells (P<0.01).Combined 96 h after the test group of cells to death based,less apoptosis;cell death was induced by 500μg/ml curcuma.Zedoary oil is the CNE2 cell block in G1 phase.Electron microscopy apoptosis ultrastructure can see that zedoary oil can be induced by CNE2 cells apoptotic body,leading to apoptosis.Conclusion Zedoary oil to increase the in vitro method role in CNE2 NPC cells can inhibit cell proliferation and induced apoptosis; Zedoary oil and small doses of γray joint role obviously synergy; mechanism and its role in apoptosis induced by tumor cells and affect cell growth cycle.

　　Key words：NPC;CNE2;Zedoary oil;γray;Radiosensitivity

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是指生长在鼻咽部位的恶性肿瘤，系人类高发的头颈部恶性肿瘤之一，95%以上为低分化鳞癌和未分化癌 [1] ，具有高转移和高复发性。NPC病因尚未明确，可能与吸烟、EB病毒感染、进食腌制食品、居住环境受污染有关。

　　近年来在NPC诊断和治疗方面，大量的基础和临床研究已经取得了一定的成果，但其预后仍然不理想，高转移和高复发性使该病的放射治疗存在着较高的治疗失败率[23]，为此，肿瘤的放化疗联合治疗及基因靶向治疗等已成为本学科的研究方向[45]。

　　目前，临床用于鼻咽癌诱导化疗的药物主要以5Fu和铂类为主，其毒副作用较大;寻找可以起到减毒增效的药物成为临床治疗亟待解决的问题。我国传统医学采用天然药物治疗肿瘤有丰富的临床经验，中草药药性温和，毒副作用相对较少，不但可以与化疗药物同时应用，还可以联合放疗综合应用，起到放射增敏的作用。对于一些体质差，不能耐受大剂量放化疗的中晚期鼻咽癌患者，可以提高其生存质量、延长生存期。

　　莪术油为莪术根茎所含的挥发油，近年国内外通过药理学研究发现它是一个药理活性强、高效、安全的药物[6]，具有广谱的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血和抗氧化的活性[7]，其中抗肿瘤是莪术油最主要的药理作用。这一点已经在肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌中得到证实，但在鼻咽癌领域未见报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　CNE2细胞株(由中山大学附属肿瘤医院提供);莪术油注射液(黑龙江瑞格制药有限公司生产);RPMI1640培养基、胰蛋白酶(Gibcol BRL公司);新生牛血清(四季青);其余主要试剂均为美国Sigma公司产品。凯基AnnexinFITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基)。

　　1.2 主要仪器和设备

　　CO2 培养箱、全自动酶标仪、流式细胞仪、透射电镜。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验分组 本试验设置空白对照组、5Fu对照组、实验组(稀释备用的各浓度莪术油)。

　　1.3.2 细胞培养 将处于对数生长期，生长状态良好的CNE2细胞于37℃消化，制成单细胞悬液;常规传代，在37℃ 、5%CO2的恒温培养箱中培养过夜，第二天观察细胞形态并更换培养液。

　　1.3.3 γ射线照射 60CO 机照射，加0.5cm标准填充物，距皮源80cm，根据试验需要照射剂量不同，照射后置培养箱内培养。

　　1.3.4 MTT法测定莪术油对CNE2细胞的增殖抑制 取对数生长期细胞以1×104/ml的浓度接种于6块不同的96孔细胞培养板中，每孔100μl,留调零孔，并防止边缘效应。常规孵育，24h 细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，换液;设置空白对照组、5Fu对照组和实验组，每组设6个复孔，继续置于恒温箱分别培养1～6天;每天取一个96孔板，在相应孔中加入20μl MTT，继续培养4h后终止培养，吸出上清，每孔加相同批次的DMSO 100μl，置摇床上低速振荡;用全自动酶标仪在波长492nm处比色，测定各孔OD值，取平均数值，按照以下公式计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率= (对照组吸光度值一试验组吸光度值)/(对照组吸光度值空白组吸光度值)×100% 。

　　1.3.5 流式细胞术分析细胞周期 常规收集、处理细胞后，过滤细胞悬液，除去粘连的细胞群，低速离心5min;去上清，每管加入PI染液1ml，4℃，避光30min,置流式细胞仪检测、收集数据，用MultiCycle分析软件进行细胞周期分析。

　　1.3.6 流式细胞术分析细胞凋亡率、死亡率 常规收集各组作用48小时后的CNE2细胞，严格按照凯基Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒说明操作，处理后的细胞用Beckman Coulter流式细胞仪进行检测。用相应软件分析建立Annexin VFITC vs PI双参数点图。

　　1.3.7 透射电镜检测 收集莪术油半数抑制浓度IC50和对照组培养液作用48小时后的CNE2细胞，按常规方法固定、脱水、包埋、修块、制片后，醋酸铅铀染色，透射电镜观察。

　　1.4 统计学方法

　　所有试验结果取3次的平均值，应用SPSS13.0统计学软件进行方差分析、析因分析,P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测莪术油对CNE2细胞的增殖抑制情况

　　莪术油在较低浓度时(5μg/ml)，对体外鼻咽癌细胞CNE2生长有促进作用，且其促进生长作用与各浓度和对照组之间差异有统计学意义(P=0.000);在较高浓度时对鼻咽癌细胞生长有抑制作用，并随浓度的增高，抑制作用增强;与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01) ;检测6天范围之内以48h的抑制率均数最高(48.78%);且各个实验组随时间的延伸抑制率变化无明显规律;6天内两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1;各实验组的莪术油与相应浓度的5Fu对CNE2细胞的增殖抑制差异无统计学意义(P>0.05)。在此仅分析作用48h的曲线，见图2。

　　2.2 莪术油诱导CNE2细胞48小时后的凋亡率、死亡率

　　莪术油对CNE2细胞的生长抑制有明显的浓度依赖性，以作用48h为最大的药物抑制时间，5μg /ml、10μg /ml组对细胞的生长抑制与对照组比较差异无统计学意义，300μg/ml组作用48h后出现明显抑制作用并诱导细胞凋亡(P<0.01)，500μg /ml组以上细胞死亡率大于凋亡率，具有明显的细胞毒性，见表1。

　　2.3 莪术油和γ射线联合后CNE2细胞的凋亡率、死亡率

　　2.3.1 5μg /ml、100μg /ml、300μg /ml的莪术油分别联合50cGy的γ射线作用1、2、4天后，无明显的放疗增效作用。

　　2.3.2 5μg /ml、100μg /ml、300μg /ml的莪术油表1 莪术油诱导CNE2细胞 48h后的凋亡率、死亡率分别联合100cGy的γ射线作用1天对细胞无明显作用，2天后联合作用组的凋亡率由0.5%、2.15%、10.2%显著提高到8.6%、14%和26%，见图3。细胞的死亡率均在5%以下，联合作用4天后细胞主要以死亡为主而凋亡较少。

　　2.3.3 5μg/ml 、100μg/ml、300μg/ml的莪术油分别联合200cGy的γ射线作用1、2、4天后，对肿瘤的抑制作用主要表现为死亡，细胞的凋亡率明显下降。

　　2.4 流式细胞仪分析细胞周期的结果

　　观察莪术油、莪术油+100cGy的γ射线对CNE2细胞分别作用24h、48h、96h三个时间点的细胞周期变化情况，均发现细胞阻滞在G1期，而S期、G2/M期细胞比例均有下降;尤其以作用48h时，细胞大量堆积阻滞在G1期，S期、G2/M期细胞比例均明显下降，在此仅详述48h结果，见表2。表2 药物作用48h对CNE2细胞周期的影响

　　2.5 透射电镜的检测结果

　　对照组可见细胞核大，核膜完整，核浆比例失调，核仁较清楚，胞质中细胞器较完整，细胞表面有微绒毛，可见明显的细胞分裂现象。实验组可见细胞微绒毛减少，细胞核固缩，染色质致密、边集，可以见到大量凋亡小体形成,见图4～6。

　　3 讨论

　　在莪术油抗肿瘤的研究中，有实验证实[811]：莪术油有显著的抗肿瘤作用，这种作用的机制在一定程度上是诱导细胞凋亡;也有报道指出莪术油有直接细胞毒作用，可致肿瘤细胞变性坏死;我们通过构建NPC体外模型，通过Annexin与 PI 双染及细胞周期[12]的研究，初步探讨莪术油对鼻咽低分化鳞癌CNE2细胞的抑制作用，也得到上述结论。莪术油抗CNE2细胞呈现浓度依赖性，在300μg/ml作用48h后出现明显抑制作用并诱导细胞凋亡(P<0.01)，500μg/ml以上细胞死亡率大于凋亡率，具有明显的细胞毒性;各浓度和相应浓度的5Fu组对CNE2细胞的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05);并且，各实验组随时间的延伸抑制率变化无明显规律，以作用48h抑制率最高，说明莪术油对CNE2的抗癌作用，其剂量依赖性较时间依赖性在实际应用中更有参考价值，这一点与盛、赵、谭、吴、赵等[1317]的在肺癌、胃癌、肝癌、人子宫内膜癌中的报道一致。沈洪等[18]在研究中发现，莪术是通过抑制COX2及其下游PGE2表达，使VEGF表达下调而抑制肿瘤的。我们的实验显示：莪术油诱导CNE2细胞产生最高凋亡率的时间点为48h，且动态观察莪术油、莪术油+100cGy的γ射线对CNE2细胞作用24、48、96h三个时间点的细胞周期变化情况，均发现细胞堆积阻滞在G1期，而S期、G2/M期细胞比例均明显下降，尤其以作用48h时，细胞大量阻滞在G1期，这就表明莪术油可以阻断癌细胞由G0/G1期向S期、G2/M期的移行过渡。因此，我们认为：诱导细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞DNA合成及增殖活性可能是莪术油抗鼻咽癌机制的一个重要方面。

　　莪术油和γ射线联合作用显示：5μg /ml、100μg /ml、300μg /ml的莪术油联合100cGy的γ射线作用2天后凋亡率由0.5%、2.15%、10.2%显著提高到8.6%、14%和26%，细胞的死亡率均在5%以下;说明莪术油与小剂量γ射线联合作用对CNE2细胞有明显的放疗增敏作用[19](P<0.01);糜福顺[20]在肺癌中的研究也证实了莪术油能够起到放射增敏的这一特点。但在头颈肿瘤领域未见相关报道。目前具有增敏作用的中药多为活血化瘀药，其增敏机制不明了，可能与其降低血液黏滞度、扩张周围血管、改善瘤床血供、提高肿瘤局部氧含量、诱发端粒酶活性等，增进瘤细胞对放射线的敏感性有关[2124]，尚待进一步研究。

　　另外，有实验证实[25]，莪术可明显提高小鼠的免疫功能，莪术水煎对受300cGy照射小鼠的造血、免疫及微循环功能具有保护作用;给动物预注莪术油，可增强动物抗射线照射能力;用1%莪术油膏外涂可预防射线对皮肤的照射损伤。同时，莪术还可以明显降低人癌细胞VEGF、PGE的含量，降低癌细胞的转移率。

　　电镜结果显示：实验组可见细胞微绒毛减少，细胞核固缩，染色质致密、边集，可以见到大量凋亡小体形成;而对照组癌细胞的电镜超微结构可见细胞发育良好，核大，核膜完整，核浆比例大，仁较清楚，胞质中细胞器较完整，细胞表面微绒毛丰富，明显核分裂象。肿瘤细胞发生凋亡以后自然会失去其恶性增殖的活性[26]。这一点在我们的实验中也得到再次证实。

　　综上所述，我们可以明确的看到，莪术油可以抑制并诱导鼻咽低分化鳞癌CNE2细胞凋亡，其抑制作用与传统化疗药物5Fu比较差异无统计学意义，并能够增加射线对鼻咽癌细胞的放疗敏感性,提高放射线对肿瘤细胞的杀伤率,显著增强放疗效果。这说明莪术油可能成为一种低毒、高效、可提高肿瘤患者机体免疫力的、新的化疗或化疗辅助药物;同时也是对放射治疗有一定机体保护作用的、有前途的放疗增敏剂，并对转移性复发性鼻咽癌的治疗存在良好的前景，但其抗肿瘤作用的深层次研究还需要进一步开展,如基因芯片检测cDNA中的凋亡相关基因、细胞周期调控基因的表达变化,明确莪术油抗NPC的机制，为基因药物的研制和开发打下理论基础。同时，还可以从莪术油诱发免疫保护效应的方面入手，深入研究瘤苗主动免疫的机制，研制出NPC的特异性杀伤性疫苗——莪术油疫苗。

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