bFGF和TNFα在颈椎后纵韧带骨化中的作用

作者：王修文作者单位：山东大学第二医院骨科， 山东 济南 250033

     【摘要】  目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肿瘤坏死因子(TNFα)在颈椎后纵韧带中的表达水平及在骨化发病机制中的作用。方法：采用免疫组织化学法，对30例骨化颈椎后纵韧带标本进行bFGF和TNFα检测，与40例正常颈椎后纵韧带标本进行对照，再利用SPSS10.0行FISHER精确检验，分析有无统计学意义。结果：正常对照组bFGF表达10例阳性，30例阴性，阳性率25%；颈椎后纵韧带骨化组bFGF表达24例阳性，6例阴性，阳性率80%，差异有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组TNFα表达32例阳性，8例阴性，阳性率80%；颈椎后纵韧带骨化组TNFα表达10例阳性，20例阴性，阳性率33.3%，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：bFGF的异常高表达和TNFα的低表达促进了颈椎后纵韧带骨化的发生，这两种因子的异常表达在该病发病机制中有重要作用。

【关键词】  纵韧带 成纤维细胞生长因子2 肿瘤坏死因子

     WANG Xiuwen， QIAO Yong， WU Dongjin

    (Department of Orthopaedics, Second Hospital of Shandong University,

    Jinan 250033, Shandong, China)

    ［ABSTRACT］  Objective: To investigate the expression and function of bFGF and TNFα in the ossification of the posterior longitudinal ligament(OPLL)  of the cervical spine.  Methods:  Thirty specimens and 40 normal controls were used in this study.  The immunohistochemical method (SABC) was applied to determine the expression levels of bFGF and TNFα. SPSS(version 10.0) software was used to analyze the data. Results:  Ten specimens of normal posterior longitudinal ligaments were positive for bFGF (25%) and twentyfour specimens with COPLL were positive for bFGF (80%). Thirtytwo specimens of normal posterior longitudinal ligaments were positive for TNFα(80%) and ten specimens with COPLL were positive for TNFα (33.3%). There was a significant difference (P＜0.05). Conclusions: The expression of bFGF in patients with COPLL is higher than that in  normal posterior longitudinal ligaments(P＜0.05). High expression of bFGF and low expression of TNFα play an important role in the pathogenesis of COPLL.

    ［KEY WORDS］  Longitudinal ligaments; Fibroblast growth factor 2;  Tumor necrosis factor    颈椎后纵韧带骨化(ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine, COPLL)压迫脊髓有导致瘫痪的危险。自从1964年日本学者［1］正式命名以来，各国学者对其病因的研究主要集中在损伤和椎间盘突出，脊柱退变，内分泌障碍，骨代谢性疾病及感染因素。由于该病的复杂性，目前其病因仍不明确。国外有研究认为细胞因子对骨的生长和重建有重要影响。对于细胞因子的深入研究发现可能有一种新的治疗手段替代传统的手术治疗方法，实现本病的治疗由巨创到微创的转变。本研究的目的，通过免疫组织化学的方法分析bFGF、TNFα在颈椎后纵韧带中的表达水平及对颈椎后纵韧带骨化发病机制的影响。

    1  资料与方法

    1.1  资料

    1.1.1  临床资料  采用山东省立医院和山东大学齐鲁医院颈椎手术中所取标本，其中COPLL组30例，正常对照组40例，均经影像学检查确认。颈椎后纵韧带骨化组，年龄48 75岁，平均(60.67±9.84)岁，男20例，女10例。正常对照组，年龄46 74岁，平均(61.05±7.5)岁，男24例，女16例。

   1.1.2  试剂  bFGF和TNFα单克隆抗体、正常山羊血清封闭液、生物素化山羊抗体小鼠IgG、SABC免疫组织化学试剂盒、ED1022显色剂均购自武汉博士德公司。

    1.1.3  实验器材  包埋机系德国LEICA公司产；Clympus光学显微镜系Olympus公司产；电热烘干箱系山东潍坊医药集团有限公司产；台式高速离心机由上海医疗仪器厂提供；恒温箱购自北京医疗设备厂。

    1.2  方法

    1.2.1  石蜡切片制作  将标本置于甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚5?μm，HE染色后经病理学检查确认。

    1.2.2  免疫组织化学染色  bFGF和TNFα的免疫组织化学染色及检测：分别以单抗为一抗，以SABC法对切片染色，DAB显色，封片。光学显微镜观察其分布情况，阳性染色者细胞质和细胞间质内有黄色颗粒。具体方法如下：载玻片防脱片剂处理：捞片后置烤箱60?℃ 30?min使切片紧密粘附;切片常规脱蜡至水;蒸馏水新鲜配制3%过氧化氢，室温10?min灭活内源酶，蒸馏水洗3次;滴加复合消化液10?min，蒸馏水洗3次;滴加正常山羊血清封闭液，室温20?min，甩去多余液体不洗;滴加适当稀释的一抗，37?℃1?h。0.1?mol/L相对分子质量 PBS洗2?min×3次;滴加生物素化山羊抗体小鼠IgG，20 37?℃ 20?min。0.1?mol/L相对分子质量 PBS洗2?min×3次;滴加试剂SABC，37?℃ 20?min。0.1相对分子质量 PBS洗5?min×4次;DAB显色：使用ED1022DAB显色试剂盒。取1?ml蒸馏水，加入试剂盒中A、B、C试剂各1滴混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，约10?min，蒸馏水洗涤终止反应;苏木素轻度复染,脱水，透明，中性树胶封片。

    1.3  统计学处理  采用SPSS10.0版本进行FISHER精确检验，按P值判断各组间差异有无统计学意义。颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组bFGF表达P值为0.002；颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组TNFα表达P值为0.013。

    2  结  果

    2.1  光学显微镜观察  在HE染色切片中，正常后纵韧带纤维组织排列整齐，细胞较少，骨化组中细胞成分多,可见核分裂相，且纤维排列紊乱、肿胀。在免疫组织化学切片中，正常对照组bFGF 10例阳性，30例阴性，见图1、图2。骨化组bFGF表达24例阳性，6例阴性，见图1、图2。TNFα在正常对照组32例阳性，8例阴性；在颈椎后纵韧带骨化组10例阳性，20例阴性，见图3、图4。

    2.2  表达水平检测  见表1。颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组bFGF表达统计学处理：P值为0.002，bFGF在颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组间的表达水平差异有统计学意义(P＜0.01)。颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组TNFα表达统计学处理：P值为0.013，因此TNFα在颈椎后纵韧带骨化组与正常对照组间的表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)。

　　3  讨  论

    颈椎后纵韧带骨化发生的病因不明确，研究发现可能和多种因素有关［25］。Inamasu J［6］认为后纵韧带骨化是多因素导致发病，其中包括遗传和环境的相互作用。Horikoshi T［7］认为转化生长因子和核结合因子也参于了骨化过程。Inoue I［8］研究发现早幼粒细胞白血病锌指基因（promyelotic leukemia zinc finger ，PLZF）和肿瘤坏死因子刺激基因(tumor　necrosis　factorstimulated　gene6,TSG6)与骨化有关。

    bFGF在正常情况下以储存形式存在于细胞外基质，呈无活性状态 。当机体受到某些刺激，可以增加bFGF受体高亲和部分的表达，使bFGF从低亲和部位向高亲和部位转移，以便对靶细胞产生作用。bFGF对体外培养的细胞可延缓衰老、延长成活期、诱导胚胎发育、肢体再生、促进神经系统发育、促进创伤修复和肿瘤的生长。目前认为，bFGF最基本的作用是新生血管的生成，它是血管内皮细胞强有力的有丝分裂原，是最重要的血管生成因子。

 在本研究中，正常对照组bFGF表达阳性率只有25%，而COPLL组阳性率高达80%，这就提示我们bFGF很可能在该病的发病中有重要作用。而它的作用很可能是通过多种机制实现的：首先颈椎间盘退行变性后，椎体间不稳则会产生错动，会牵拉纤维环及四周韧带，从而牵拉椎体边缘，可引起骨膜下出血。血肿机化、骨化即产生骨质增生，形成骨刺和骨嵴，渗入后纵韧带下，就形成了后纵韧带骨化。在此过程中，出血和缺氧可能使储藏于细胞外基质中的bFGF更多地释放出来，并增加对高亲和力受体的结合，这就使其充分发挥了促进血管生成的作用，而椎间隙错动越严重，血管生成越多，出血也就越多，血肿机化、骨化过程越强烈，bFGF通过激活基因表达的两条信号传导通路，使静止的成纤维细胞和软骨细胞等快速进入细胞循环周期。纤维细胞增殖分化,使胶原纤维和弹性纤维含量增加，通过纤维化、机化、骨化形成后纵韧带骨化，而软骨细胞的分裂增殖,使后纵韧带内形成软骨，Line在其研究中已证实：颈椎后纵韧带骨化为软骨内化骨,这说明软骨细胞的增殖与颈椎后纵韧带骨化有密切联系。体外后纵韧带的细胞培养试验证明，在拉力状态下，细胞分泌BMP增多［9］。

    本研究中，正常对照组TNFα表达阳性率80%；而颈椎后纵韧带骨化组表达阳性率只有33.3%。这就说明TNFα也参与颈椎后纵韧带骨化过程。TNFα有抑制内皮细胞增殖和促进骨质及软骨吸收的作用。TNFα的缺失将导致内皮细胞进行增殖，从而形成新生血管，新生血管的生成将增加形成血肿的可能，骨化的几率就增加了。而且TNFα还有促进骨质吸收和促进软骨吸收的作用，它的缺失会使软骨生成增加，软骨内化骨的过程将增强，形成更多骨化组织。

    综合来看，在损伤和出血等始动因素作用下，可能促进基质中bFGF的形成和释放，这就促进了新生血管及胶原纤维和弹性纤维的生成，并使成骨细胞和软骨细胞快速进入细胞周期。TNFα的缺失则减少了对软骨内化骨和骨化形成的抑制，并使新生血管形成增加，可能是颈椎后纵韧带骨化形成的原因之一。  

    显然，还有多种细胞因子参与颈椎后纵韧带骨化的形成，并形成调节网络，互相调节，控制着颈椎后纵韧带骨化的发病。关于颈椎后纵韧带骨化的发病机制，各国学者在多层次上的研究取得了很大成果，但还没有形成共识。本实验首次考虑了bFGF和TNFα在颈椎后纵韧带骨化中的作用，为研究后纵韧带骨化的发生机制开辟了新思路。以上这些因素是否在分子水平有相同的作用机制，共同导致了颈椎后纵韧带骨化的发生，还有待我们继续探讨。相信随着对该病在细胞分子水平和基因水平研究的深入，人类完全可能利用新的理论做指导，找到新的方法阻断颈椎后纵韧带骨化的发展，甚至可以预防和延缓颈椎后纵韧带骨化的发病。

【参考文献】  ［1］ Terayama K, Mamiya N, Suzuki A. Ossification of the posterior longitudinal ligament of the cervical spine［J］. Orthopeadic Surgery, 1964, 15(5):1?8011?805.

［2］ Wada A. Affinity of estrogen binding in the cultured spinal ligament cells: an in vitro study using cells from spinal ligament ossification patients［J］. Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi, 1995, 69(7):440449.

［3］ Koga H, Hayashi K, Taketomi E, et al. Restriction fragment length polymorphism of genes of the alpha 2(XI) collagen, bone morphogenetic protein2, alkaline phosphatase, and tumor necrosis factoralpha among patients with ossification of posterior longitudinal ligament and controls from the Japanese population［J］. Spine, 1996, 21(4):469473.

［4］ Furusawa N, Baba H, Imuraa S, et al. Characteristics and mechanism of the ossification of posterior longitudinal ligament in the tiptoe walking Yoshimura(twy) mouse［J］. European Journal of Histochemistry, 1996, 40(3):199210.

［5］ Kamiya M, Harada A, Mizuno M, et al. Association between a polymorphism of the transforming growth factorbetal gene and genetic susceptibility to ossification of the posterior longitudinal ligament in Japanese patients［J］. Spine, 2001, 26(11):1?2641?266.

［6］ Inamasu J, Guiot BH, Sachs DC. Ossification of the posterior longitudinal ligament: an update on its biology, epidemiology, and natural history［J］. Neurosurgery， 2006， 58(6)：1?0271?039.

［7］ Horikoshi T, Maeda K, Kawaguchi Y, et al. A largescale genetic association study of ossification of the posterior longitudinal ligament of the spine［J］. Human Genetics, 2006, 119(6):611616.

［8］ Inoue I, Ikeda R, Tsukahara S. Promyelotic leukemia zinc finger (PLZF) and tumor necrosis factoralphastimulated gene 6 (TSG6) identified by gene expression analysis play roles in the pathogenesis of ossification of the posterior longitudinal ligament［J］. Journal of Pharmacological Sciences, 2006, 100(3):205210.

［9］ Tanno M, Furukawa KI, Ueyama G, et al. Uniaxial cyclic stretch induces osteogenic differentiation and synthesis of bone morphogenetic proteins of spinal ligament cells derived from patients with ossification of the posterior longitudinal ligaments［J］. Bone, 2003, 33(4):475484.