全脑缺血再灌注大鼠额、颞、顶叶NT-3和FGF的表达

　　作者：刘娜 李爱丽 邢杰 作者单位：镇江市第一人民医院神经内科，江苏 镇江 212002

　　【摘要】 目的 探讨血管性痴呆大鼠额、颞、顶叶的神经营养因子-3(NT-3)和成纤维细胞生长因子(FGF)的含量变化，揭示血管性痴呆的发病实质。方法 选用Wistar老龄大鼠随机分为假手术组(4只)，实验组。实验组再分为全脑缺血15 min组，缺血15 min再灌注1、6 h、2、4、9 d组，每组5只。用免疫组化ABC法检测缺血再灌注不同时相额、颞、顶叶NT-3和FGF含量。结果 正常老龄大鼠额、颞叶有少量NT-3表达，但顶叶无NT-3表达。额叶缺血再灌注1 h NT-3表达迅速增加，并持续到再灌注4 d，再灌注9 d减量;颞叶再灌注2～4 d NT-3表达出现高峰;顶叶再灌注6 h～9 d出现NT-3少量表达。正常老龄大鼠额、颞、顶叶均有少量FGF表达;额叶再灌注6 h FGF表达开始增加，再灌注2～4 d出现高峰;颞、顶叶再灌注6 h，FGF表达也开始增加，再灌注4 d出现高峰。结论 额叶对缺氧、缺血具有反应速度快、作用时间长的NT-3保护机制，颞叶这种保护机制略弱于额叶，顶叶缺乏这种良好的保护机制;额、颞、顶叶均具有良好的FGF神经元保护机制。

　　【关键词】 大鼠;NT-3;FGF;全脑缺血;额叶;颞叶;顶叶

　　近年来神经营养因子(NTFs)与血管性痴呆的相关研究已引起科学家们的高度关注〔1〕。NT-3和FGF是神经营养因子家族中的两个成员，由于二者被发现较晚，因此有关研究相对较少。关于血管性痴呆时额、颞、顶叶与NT-3、FGF之间的关系尚不清楚。本研究选用老龄大鼠制作血管性痴呆模型，应用免疫组化技术研究痴呆大鼠额、颞、顶叶NF-3和FGF的含量变化，探讨NT-3 、FGF与血管性痴呆的关系，旨在分子水平上揭示血管性痴呆的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选用Wistar老龄大鼠42只(由吉林大学动物室提供)，雌性26只，雄性16只，体重420～520 g，12月龄。颗粒饲料喂养，雌雄分开饲养并随机分组，假手术组4只;实验组分脑缺血15 min组，脑缺血15 min再灌注1和6 h、2、4、9 d 5组，每组5只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备 采用Pulsinelli-Brierley血管阻塞法进行改良，用10%水合氯醛给大鼠进行腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)，分离双侧颈总动脉，用两根缝合线分别绕过每侧颈总动脉系一松套脉(待次日拉套断流用)，电凝双侧椎动脉24 h后在大鼠清醒状态下拉双侧颈总动脉套，阻断双侧颈总动脉血流15 min，此为脑缺血期，去除颈总动脉套为再灌注期。假手术组不做椎动脉电凝、颈总动脉断流，其余过程同实验组。各组大鼠在完成实验过程后给予10%水合氯醛过量腹腔麻醉，暴露心脏，剪开右心耳，在左心室插管，先用200 ml生理盐水灌冲，然后用4%多聚甲醛固定脑组织，取脑分离出额、颞、顶叶，脑组织置于相同固定液中48 h，石蜡包埋，免疫组化染色采用ABC法。试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。

　　1.2.2 测定指标 以在神经元、间质细胞中出现棕黄色或棕褐色颗粒判断为阳性细胞。几乎无阳性细胞为无表达，用(-)表示;阳性细胞占20%以下为少量表达，用(+)表示;阳性细胞占20%～40%为中量表达,用()表示;阳性细胞占40%以上，为大量表达，用()表示。

　　2 结果

　　2.1 NT-3表达 见表1。假手术组额叶和颞叶均有少量NT-3表达，但顶叶没有NT-3表达;缺血15 min组上述三个脑区的NT-3表达程度均无变化。再灌注1h时，大鼠额叶NT-3表达增至中量，而大鼠颞叶和顶叶NT-3表达仍保持在原基础水平上;再灌注6 h时，顶叶出现NT-3少量表达，额叶和颞叶NT-3表达情况与再灌注1 h情况相同;再灌注2～4 d，颞叶NT-3表达增至中量，而额叶和顶叶的NT-3再灌4 d表达情况与再灌注6 h情况相同;再灌注9 d，上述三个脑叶NT-3表达均呈少量。

　　2.2 FGF表达 见表1。假手术组额、颞、顶叶均有少量FGF表达，且缺血15 min和再灌1 h组上述脑叶FGF表达均仍呈少量表达。再灌注6 h，上述脑叶FGF表达同时增为中量;再灌注2 d，额叶FGF增为大量表达，余两脑叶FGF仍呈中量表达;再灌注4 d，额、颞、顶叶FGF表达同增为大量表达;再灌注9 d，三个脑叶FGF表达又同降为中量表达。

　　表1 全脑缺血再灌注大鼠额、颞、顶叶NT-3和FGF的表达(略)

　　3 讨论

　　3.1 额、颞、顶叶NT-3的表达 NT-3是一种碱性蛋白质，分子量为13.6 kD，在神经系统中，NT-3主要分布于背根脊髓、脑干、小脑和海马等，在非神经系统，NT-3主要分布在脾、肾和肠，最近有报道大鼠胃和睾丸也有分布。体外研究证实，NT-3功能广泛，对交感神经元、感觉神经元、运动神经元、胆碱能神经元均有重要作用，故对周围神经炎、脊髓损伤、脑损伤、痴呆、肌萎缩侧索硬化等有治疗作用。NT-3能在体外上调胆碱能神经元乙酰胆碱转移酶的表达，支持多巴胺神经元分化;促进发育和损伤的皮质脊髓束侧枝出芽，可促进本体感觉神经分化及轴突向靶点扩展和投射形成;能使受损的神经元长出侧芽，促进神经损伤修复。应用NT-3可使3/4的萎缩细胞逆转，存活细胞的数量也明显增加〔2〕;能使神经干细胞分化成γ-氨基丁酸能、胆碱能神经元及星形胶质细胞〔3〕。NT-3能维持神经干细胞存活，促进增殖和分化;维持周围神经系统感觉神经元和交感神经元及中枢神经系统运动神经元存活。将Trkc基因转入神经干细胞后移植正常脊髓，无论移植前给予NT-3还是移植后再给予NT-3均能促进神经干细胞存活，并使其向神经元分化〔4〕。

　　本研究结果表明，正常老龄Wistar大鼠额、颞叶有少量NT-3分布，但顶叶缺乏NT-3。缺血15 min时三个脑叶NT-3表达均无变化，这说明短暂脑缺血损害尚不足以上调这些脑区内源性NT-3。再灌注1 h～4 d，额叶NT-3呈中量表达，这表明额叶NT-3对缺血、再灌注损伤敏感，具有反应速度快、作用时间长的NT-3保护机制，这种保护机制直到再灌注9 d才减弱。颞叶再灌注2 d之前，NT-3表达呈少量，再灌注2～4 d增至中量表达，这说明颞叶NT-3对缺血、再灌注损伤的敏感性较额叶略低，但再灌注2 d之后颞叶具有与额叶一样程度的NT-3保护机制，即在缺氧、缺血的条件下颞叶NT-3的保护机制略差于额叶。顶叶再灌注6 h之前无NT-3表达，在此之后出现少量表达，这表明顶叶在生理状态下即缺乏NT-3保护机制，且对缺氧、缺血的敏感性也较弱，故顶叶缺乏良好的NT-3保护机制。顶叶是空间定向功能的重要整合脑区，在NT-3保护机制方面，顶叶较额、颞叶的劣势似乎解释了老年人及血管性痴呆患者容易发生定向障碍。

　　3.2 额、颞、顶叶FGF的表达 FGF是从牛脑及其垂体组织中提取的一种多肽因子，因对培养的成纤维细胞有促增殖作用而被命名。目前明确FGF不是一个因子，而是由多种因子组成的一个家族，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是其中的两种。FGFs生物活性广泛，具有如下作用：①刺激大血管和毛细血管的内皮细胞增殖与迁移，释放间质降解酶，故被认为是血管生成因子，诱发毛细血管再生。如脑血管阻塞时，常有旁路血管形成。②促进创伤愈合和组织修复。③FGFs是强分化诱导剂，维持中枢神经系统的正常功能，延缓细胞衰老。④调节内分泌作用。⑤对多种神经元有营养作用。在海马神经元培养研究中，结果显示bFGF能明显缓解谷氨酸引起的海马神经元兴奋性死亡，其可能机制〔5〕：bFGF与受体结合，在G蛋白引起P42/44MAPK磷酸化水平升高，后者进入细胞核调节相关基因表达，抑制NMDA受体表达，诱导抗氧化酶表达，阻断缺血所致的PKC失活，从而抑制由PKC失活引发的细胞凋亡。

　　本研究结果表明，正常老龄Wistar大鼠额、颞、顶叶均有少量FGF分布，缺血再灌注6 h时，额、颞、顶叶同时出现FGF中量表达，这表明上述三个脑叶的FGF对缺氧、缺血均比较敏感，具有反应迅速的FGF保护机制。再灌注2～4 d，额叶FGF含量达高峰，呈大量表达，此后降为中量表达，这表明额叶对应激状态具有反应快、作用持久的FGF保护机制。再灌注4d，颞、顶叶均出现大量FGF表达;再灌注9 d，二者的FGF同时呈中量表达，这表明颞、顶叶对应激状态也具有反应快、作用持久的FGF保护机制，只是在程度上略弱于额叶。总之，这三个脑叶均具有良好的FGF神经元保护作用，这使它们对缺氧、损伤具有较强的耐受力。

　　脑缺血再灌注损伤能引起额、颞、顶叶NT-3和FGF阶段性增加，但最终导致这两种神经营养因子下降。神经元处于缺乏神经营养因子支持的内环境，势必容易受到损害、退化、变性及凋亡，其结果可能是造成痴呆的原因之一。

　　【参考文献】

　　1 田纪律，李家顺，贾连顺，等.大鼠脊髓半切伤后运动功能的可修复性〔J〕.中国临床康复，2003;7(20)：2822-923.

　　2 Bradvry EJ. NT-3，but not BDNF，prevents atrophy and death of exotomied spinal cord projection neurons〔J〕.Eur J Neurosci，1998;10 (10)：3058.

　　3 Tzeng SF.Neural progenitors isolated from newborn rat spinal cords differentiate into neurons and astrogalia〔J〕.J Bioned Sci，2002;9(1)：10-6.

　　4 Castellanos RA，Tsoulfas P，Frydel BR,et al.Trkc overexpression enhances survival and migration of neural stem cells transplants in the rat spinal cord〔J〕.Cell Transplant，2002;11(3):297-307.

　　5 Abe K，Saito H.Neurotrophic effect of basic fibroblast growth factor is mediated by the p42/p44 mitogen-activated protein kinase cascade in cultured rat cortical neurons〔J〕.Dev Brain Res，2000;122 (1)：81-5.