NF-κB在β-淀粉样蛋白25-35诱导分化PC12细胞中的作用

　　作者：张晓林 于明 包晓群 作者单位：江苏大学附属医院神经内科，江苏 镇江 212002

　　【摘要】 目的 探讨NF-κB在Alzheimer病(AD)中的作用。方法 对Aβ25-35抑制PC12细胞生长的时间-效应关系和剂量-效应关系进行分析，确定Aβ25-35抑制PC12细胞生长的IC50和最大抑制效应出现的时间(X小时)。对IC50浓度的Aβ25-35作用X小时的PC12细胞和正常PC12细胞进行NF-κB P65 mRNA及其蛋白检测，其中NF-κB P65 mRNA采用RT-PCR法，NF-κB P65蛋白采用Western印迹法。结果 Aβ25-35在36 h对PC12细胞的生长抑制作用最强，Aβ25-35抑制PC12细胞生长的IC50约为30 μmol/L;Aβ25-35能使NF-κB P65 mRNA及其蛋白表达明显增加。结论 NF-κB能够促进AD中细胞凋亡的发生。

　　【关键词】 淀粉样β蛋白;PC12细胞;核转录因子

　　Alzheimer病(AD)的发病原因及其机制尚不明确，相继提出了胆碱能假说及β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化、基因突变等学说。近年来，细胞凋亡在AD发病中的重要作用又成为人们研究的焦点。核因子-κB(NF-κB)在细胞凋亡的过程中发挥着一定作用。本研究通过NF-κB P65 mRNA及其蛋白在Aβ25-35诱导分化PC12细胞过程中的表达变化，旨在阐明NF-κB在AD中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 鼠嗜铬细胞瘤株PC12细胞由吉林大学第一医院神经内科胡林森教授惠赠。Aβ25-35(购自首都医科大学宣武医院多肽室);DMEM、胎牛血清(美国Gibico公司);二甲基亚砜(DMSO)、四唑盐(Sigma公司);DL-2000 DNA Marker 购自北京鼎国;Taq DNA聚合酶购自北京纽英伦生物技术有限公司;兔抗鼠NF-κB P65抗体(美国Santa Cruz Biotechnology);引物由上海森工生物工程有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 将PC12细胞培养在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2 的孵箱中培养。3、4 d传代1次，隔天换液1次。

　　1.2.2 Aβ25-35抑制PC12细胞生长时间-效应关系和剂量-效应关系的分析 ① 以120 μmol/L Aβ25-35为最高浓度，对向下2倍稀释的8个浓度梯度的Aβ25-35进行时间-效应观察，确定Aβ25-35对PC12细胞的最大抑制效应出现的时间点/时间段;② 上述倍数稀释的8种浓度Aβ25-35作用PC12细胞n小时(该时间为剂量-效应关系所确定的最大抑制效应出现的时间)，绘制各浓度的Aβ25-35对PC12细胞生长的抑制曲线，并应用Softmax pro软件计算出Aβ25-35诱导PC12细胞的IC50。

　　1.2.3 NF-κB P65 mRNA的检测 按Trizol试剂盒说明提取总RNA。用紫外分光光度仪测定A260/A280，比值在1.9～2.0之间，计算RNA含量。引物设计参照文献〔4〕：①鼠NF-κB P65：正义链:5′-AAGATCAATGGCTACACAGG-3′;反义链：5′-CCTCAATGTCTTCTTTCTGC-3′(扩增产物493 bp)②鼠β-actin:正义链：5′-ATTTGCACCACACTTTCTACA-3′;反义链：5′-TCA CGCACGATTTCCCTCTCAG-3′(扩增产物380 bp，为内参照)。逆转录反应按试剂盒操作。RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。

　　1.2.4 NF-κB P65蛋白的检测 采用Western印迹法。总蛋白提取：4℃收集细胞，每孔加入100 μl细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L pH 8.0 EDTA、1% NP40、0.05% PMSF、2 μg/ml Aprotinin、0.5 μg/ml Leupeptin)，超声破碎，4℃ 12 000 r/min 离心5 min，收集上清液。细胞核蛋白提取：参照文献〔5，6〕，略改动。蛋白质样品与等体积2×上样buffer混匀，煮沸5 min，紫外分光光度仪测定蛋白质浓度。按蛋白含量测定结果每孔上样50 μg，12.5% SDS-PAGE分离样品。低温100 V 3 h 将蛋白转至硝酸纤维膜上，用封闭液(5%脱脂奶粉、0.02%Tween-20、3%BSA溶于PBS)室温封闭2 h，将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体1∶500)室温孵育2 h，PBS洗5 min×3次，TBS洗5 min×4次，将膜与溶于二抗稀释液(5%脱脂奶粉、0.02% Tween-20、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)中的二抗室温孵育1 h，TBS洗5 min×4次，将膜装入可热接封的塑料袋，加入ECL试剂，暗室曝光、显影、定影，对X光底片拍照保存。

　　1.3 统计学处理 数据用x±s表示，采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 Aβ25-35抑制PC12细胞生长的时间-效应关系 分析Aβ25-35抑制PC12细胞生长的时间-效应关系发现，每种浓度Aβ25-35对PC12细胞生长抑制会随着时间延长而提高，但超过一定时限，抑制率又会降低。每种浓度Aβ25-35对PC12细胞生长都有一个最大抑制率。60、120 μmol/L Aβ25-35对PC12细胞生长的抑制一直处于高水平上，作用60 h时几乎没有细胞存活;其余6种浓度Aβ25-35最大抑制效应出现在24～36 h(见图1)。

　　图1 不同浓度Aβ25-35抑制PC12生长的时间-效应关系曲线(略)

　　2.2 Aβ25-35抑制PC12细胞生长的剂量-效应关系 见图2。上述倍数稀释的8种浓度Aβ25-35作用PC12细胞36 h时，对PC12细胞的生长都有明显抑制作用，而且随着Aβ25-35浓度的增大，细胞活力受到抑制程度也逐渐增加;但当浓度达60 μmol/L以后，其抑制效应曲线增强幅度明显变缓(保证正态分布，横坐标设为log2χ-log20.935)，Softmax pro软件计算出Aβ25-35诱导PC12细胞的IC50是29.76 μmol/L。

　　图2 不同浓度Aβ25-35对PC12细胞增殖的影响(略)

　　1：DNA Marker 2：正常PC12细胞组 3：30 μmol/L Aβ25-35干预组

　　图3 不同组别NF-κB P65 mRNA表达水平(略)

　　2.3 NF-κB P65 mRNA及其蛋白的表达

　　2.3.1 NF-κB P65 mRNA表达 见图3。30 μmol/L Aβ25-35干预组PC12细胞NF-κB P65 mRNA相对表达水平明显升高(0.79±0.08)，与正常对照组(0.40±0.02)比较，有显著差异(P<0.001)，说明Aβ25-35能引起PC12细胞NF-κB P65 mRNA表达上调，促进细胞凋亡。

　　2.3.2 NF-κB P65表达 见图4。30 μmol/L Aβ25-35干预组PC12细胞NF-κB P65活性片段条带颜色比正常对照组深，说明Aβ25-35能引起PC12细胞NF-κB P65表达量增加，促进细胞凋亡。

　　1：蛋白Marker 2：正常PC12细胞组 3：30 μmol/L Aβ25-35干预组

　　图4 不同组别NF-κB P65表达水平(略)

　　3 讨论

　　在正常情况下，NF-κB与抑制蛋白(IκB)相结合以非活性形式存在于胞浆内。NF-κB的功能如同胞质中第二信使，可以传递上游信号进入细胞核，从外界应激触发、信号作用于细胞膜受体到NF-κB活化进入细胞核的过程是一个相互调节、相互影响的信号转导系统。在调节或影响NF-κB的信号递质中，氧自由基(ROS)的作用显得尤为重要。当机体受到各种氧化应激后细胞就会产生ROS，ROS即可以直接损伤细胞膜上的蛋白质或脂质，又可以作为信号递质通过诱使IκB磷酸化解离来诱导NF-κB的活化〔1〕。Aβ在水溶液中本身就可以通过自由基化成为自由基状态，或Aβ诱导分化PC12细胞时产生的·OH，都可以作为刺激信号作用于PC12细胞，激活NF-κB，使其迅速由胞浆向胞核移位，并与核内相应DNA上κB序列发生特异性结合，促进有关基因转录，进而在细胞凋亡调节方面起着重要作用。Boissière等〔2〕在AD患者基底核胆碱能神经元中就发现了激活的NF-κB。研究证实Aβ可激活神经元内NF-κB的表达，进而导致AD的发生〔3〕。

　　NF-κB与细胞凋亡的关系日益受到重视。正如前所述，有学者认为NF-κB是一种促凋亡因子，NF-κB的激活可以促进某些细胞系的凋亡〔4〕;也有学者认为NF-κB可以通过诱导细胞表达TNF受体结合分子(TRAF1、TRAF2)和凋亡抑制蛋白(IAP)，抑制Caspases级联反应，进而阻断TNF受体/Fas介导的调亡信号的转导，来抑制细胞凋亡发生〔5〕。因此，认为NF-κB激活是一个动态过程，以致于NF-κB活性上调的启动可能会遭到其他因素的逆转。国外学者研究还提出〔6〕，在神经细胞中适度的NF-κB活性可保护神经细胞免于氧化应激和凋亡，而在小胶质细胞中NF-κB的过度活化又可导致炎症级联反应。甚至有人〔7，8〕指出NF-κB即使在神经细胞凋亡网络中也具有双向性，即NF-κB既有抗凋亡作用又具有促凋亡作用，可能是NF-κB在神经细胞中受激活程度和表达量不同所致。

　　Aβ可减少分泌型淀粉样前体蛋白α(sAPPα)的生成，使sAPPα的抗凋亡作用下降，导致细胞凋亡〔9〕。在正常机体内，低浓度Aβ会导致体内sAPPα含量下降，进而刺激NF-κB的活性增加，活性增加的NF-κB又会反馈性的促进sAPPα含量增多，抵消Aβ的致凋亡作用;但是，在某种原因作用下，体内Aβ含量超过一定阈值时，引起sAPPα生成大量减少，超过了NF-κB的调节作用，细胞就会不可避免的发生凋亡〔9〕。本研究MTT法显示Aβ25-35诱导分化PC12细胞的IC50约为30 μmol/L，此剂量的Aβ远大于细胞内Aβ含量，会引起sAPPα的生成减少，超过了NF-κB的调节作用，使机体无法自我调解，就会导致细胞凋亡的发生。本研究结果显示：30 μmol/L Aβ25-35能使NF-κB P65 mRNA及其蛋白表达明显增加，提示Aβ25-35可通过NF-κB过度表达而引起细胞凋亡。

　　【参考文献】

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　　9 Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002;297(5580)：353-6.