雷公藤多甙对慢性脑低灌注大鼠海马CA1区环氧化酶2表达的影响

　　作者：张华 余昌胤 晏勇 作者单位：重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016

　　【摘要】目的 观察雷公藤多甙(TWP)对慢性脑低灌注大鼠海马CA1区环氧化酶2(COX2)表达的影响。方法 采用永久性结扎双侧颈总动脉制成大鼠慢性脑低灌注模型，在模型组的基础上，TWP低剂量组和高剂量组及生理盐水组分别予以TWP10 mg·kg-1·d-1和30 mg·kg-1·d-1及生理盐水连续灌胃，造模后1月、2月及3月应用免疫组织化学染色观察大鼠海马CA1区COX2的表达。结果 1月时，各组间COX2的表达差异无显著性(P>0.05);2月及3月，与正常对照组比较，模型组和生理盐水组COX2表达显著增加(P<0.01);与模型组和生理盐水组比较，TWP高剂量组和低剂量组COX2表达显著降低(P<0.01)，但高剂量组和低剂量组间比较差异无显著性(P>0.05)，结论 慢性脑低灌注大鼠海马CA1区COX2表达在造模后2月明显增高，TWP能下调海马CA1区COX2的表达，这种作用在高剂量和低剂量组间差异无显著性。

　　【关键词】 雷公藤多甙;慢性脑低灌注;海马;环氧化酶2

　　慢性脑低灌注所致认知功能障碍涉及髓鞘脱失、细胞凋亡、炎症反应等多种病理过程〔1，2〕。环氧化酶(COX) 为膜结合蛋白，是催化花生四烯酸(AA)生成前列腺素(PG)的限速酶，有COX1和COX2两种异构体。其中COX2与缺血性脑损伤有明显关系〔3〕。雷公藤多甙(TWP)是从卫矛科植物雷公藤根提取的活性成分，具有抗炎及免疫抑制作用，广泛用于免疫性疾病的治疗。前期报道TWP能改善慢性脑低灌注大鼠所致空间学习记忆能力〔4〕，但其确切机制尚不清楚。故本实验旨在观察TWP对慢性脑低灌注大鼠海马CA1区COX2表达的影响，探讨TWP改善慢性脑低灌注大鼠空间学习记忆能力的作用机制，为TWP用于慢性脑低灌注所致认知功能障碍等疾病的治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　清洁级健康SD大鼠105只，鼠龄8～10周龄，体重250～300 g，雌雄不拘，由第三军医大学实验动物中心提供，动物中心许可证号：SCXK(渝)20020003。采用单纯随机原则将大鼠分为：正常组、模型组、假手术组、药物对照组、生理盐水组、TWP低、高剂量组，每个观察时间点每组5只。

　　1.2 模型制作及给药方法

　　采用Cho等〔5〕报告的永久性结扎双侧颈总动脉方法复制慢性脑低灌注模型;正常组不做任何处理;假手术组除不结扎双侧颈总动脉外，其余步骤同模型组;TWP低、高剂量组和生理盐水组是在模型组的基础上，分别予以TWP(湖南协力药业有限公司，批准文号：国药准字Z43020138)10、30 mg·kg-1·d-1和与高剂量组等体积的生理盐水连续灌胃，药物对照组给予30 mg·kg-1·d-1 TWP连续灌胃，正常组、模型组和假手术组不灌任何液体。

　　1.3 标本制备

　　分别于实验开始后1月、2月和3月，麻醉大鼠，生理盐水和4%多聚甲醛经心脏冲洗、灌注固定，取脑置于4%多聚甲醛液中固定约48 h，冠状切取视交叉前后约2 mm厚的脑组织制成石蜡包埋切块，连续切取5 μm厚的切片，免疫组织化学染色。

　　1.4 COX2免疫组织化学染色

　　每只大鼠取2张切片，采用免疫组织化学标准操作规程(SABC)染色法，一抗COX2抗体(兔抗鼠IgG，Santa Cruz公司)，稀释度为1∶100，二抗生物素化山羊抗兔IgG (Santa Cruz公司)，稀释度为1∶100，实验步骤严格按说明书进行，SAB显色，苏木素复染。

　　1.5 图像分析

　　免疫组化结果在光镜观察后采用Miase3.0高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析，测定大鼠海马CA1区锥体细胞COX2表达的平均黑度值。

　　1.6 统计学方法

　　采用SPSS11.5统计软件，数据均以x±s表示，多组间比较采用q检验。

　　2 结果

　　2.1 COX2免疫组织化学染色结果

　　术后1月，各组之间海马CA1区COX2的表达差异无显著性(P>0.05);术后2月及3月，模型组和生理盐水组海马CA1区COX2的表达较正常组显著增高，(P<0.01)。TWP低剂量组和高剂量组海马CA1区COX2的表达较模型组和生理盐水组显著降低(P<0.01)，TWP高、低剂量组间以及与其余对照组间比较差异无显著性(P>0.05)。造模后1月、2月、3月各组各自进行比较，模型组和生理盐水对照组各自在三个时间点差异有显著性(P<0.01)，而正常组、药物对照组、假手术组、低剂量组和高剂量组各时间点差异均无显著性 (P>0.05)。见图1，表1。表1 各组大鼠COX2的表达(略)

　　2.2 组织病理学改变

　　术后1月，各组大鼠海马CA1区锥体细胞多而且密，形态呈锥形，排列较规则，细胞界限清晰，胞质着色均匀，无明显空泡，细胞核较清晰。术后2月及3月，模型组与生理盐水组海马CA1区锥体细胞减少，排列稀疏，细胞形态不规则，排列较混乱，细胞界限不清晰，部分细胞胞质不均匀，内有空泡形成，胞核欠清晰。而高、低剂量组及其余各组术后2月及3月与术后1月比较形态学变化不明显。见图2。

　　3 讨论

　　动静脉畸形、动静脉瘘可引起病变周围脑组织低灌注，而长期低血压和颈内动脉狭窄可引起弥漫性慢性脑低灌注，早期慢性脑低灌注患者出现认知功能障碍，持久低灌注可引起神经功能障碍的症状和体征，其病理生理过程较为复杂。COX2 的基因表达受NFκB等多种因素的调控〔6〕。COX2上调后可激活精氨酸酶3(Caspase3)，进而促使细胞凋亡〔7〕。本组结果表明，术后2月及3月，模型组与生理盐水组海马CA1区锥体细胞减少，排列较混乱，部分细胞胞质不均匀，胞核欠清晰。海马CA1区COX2表达显著增加，结合以往对定位航行潜伏期和间探索次数的观察结果，推测慢性脑低灌注大鼠海马CA1区COX2表达增高可能与海马锥体细胞减少，从而导致慢性脑低灌注性认知功能障碍有关。

　　文献报道慢性脑低灌注大鼠有明显的白质损伤，而COX2抑制剂有减轻这种白质损伤的作用〔8〕。TWP是临床应用较多的非甾体类免疫抑制剂，主要有抗炎和免疫调节等作用，广泛用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗。TWP能抑制白细胞介素1诱导的COX2的表达，抑制佐剂性关节炎大鼠炎症因子COX2和NFKB的表达〔9〕。本组实验表明：与模型组比较，TWP高、低剂量组在2月及3月时海马CA1区锥体细胞形态学变化不明显，COX2表达水平显著降低，这种作用在高、低剂量组间差异无显著性。表明TWP改善慢性脑低灌注大鼠的空间学习记忆能力与其抑制大鼠海马CA1区COX2的表达有关。

　　【参考文献】

　　1 Lee JH，Park SY，Shin YW，et al.Neuroprotection by cilostazol，a phosphodiesterase type3 inhibitor，against apoptotic white matter changes in rat after chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.Brain Res，2006;1082 (1)：18291.

　　2 Wakita H，Tomimoto H，Akiguchi I,et al.Axonal damage and demyelination in the white matter after chronic cerebral hypoperfusion in the rat〔J〕. Brain Res，2002;924 (1)：6370.

　　3 Nogawa S，Zhang F，Ross ME，et al.Cyclooxygenase2gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage〔J〕.J Neurosci，1997;17 (8)：274655.

　　4 余昌胤，张华.雷公藤多甙对慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力的影响〔J〕.中国康复医学杂志，2007;22(12)：10646.

　　5 Cho KO，La HO，Cho YJ，et al.Minocycline attenuates white matter damage in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.J Neurosci Res，2006;83 (2)：28591.

　　6 Chan PH.Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2001;21 (1)：214.

　　7 姚小梅，王纪佐，朱学良，等.脑缺血再灌注损伤与转录因子信号通路〔J〕.天津医药，2003;31(3)：1889.

　　8 Wakita H，Tomimoto H，Akiguchi I,et al.A cyclooxygenase2 inhibitor attenuates white matter damage in chronic cerebral ischemia〔J〕. Neuroreport，1999;10(7)：14615.

　　9 肖诚，何颖辉，黄芳华，等.雷公藤多甙对佐剂性关节炎大鼠自由基和炎症因子的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2006;29(6)：38992.