促红细胞生成素对Aβ25～35诱导神经细胞损伤保护作用的体外实验

　　作者：朱瑞霞 张朝东 王宏 作者单位：中国医科大学第一临床学院神经内科，辽宁 沈阳 110001

　　【摘要】目的 探讨促红细胞生成素(EPO)对β淀粉样肽(Aβ)诱导神经细胞毒性的保护作用。方法 取对数生长期的PC12细胞分为3组:空白对照组、模型组、EPO预处理组。细胞培养24 h后，EPO预处理组加入终浓度为25 U/ml的EPO预处理8 h,再与模型组同时加入终浓度为10 μmol/L Aβ25～35,继续培养48 h收集细胞检测指标。采用MTT比色法分析细胞存活率，碘化丙啶(PI)流式细胞仪检测凋亡，免疫组化检测细胞色素C(CytC)和Bcl2表达。结果 MTT显示EPO处理组细胞存活率明显高于模型组(P<0.05)，并且中剂量存活率最高;凋亡率较模型组明显下降(P<0.05);免疫组化显示：EPO处理组Bcl2阳性表达细胞较Aβ25～35处理组明显增加(P<0.05)，而EPO处理组CytC阳性染色细胞较模型组明显减少(P<0.05)。结论 EPO可以提高细胞存活率，降低凋亡率，对Aβ诱导神经细胞毒性起保护作用，其机制主要通过上调Bcl2的表达,从而抑制CytC释放,阻止细胞凋亡,促进PC12细胞存活。

　　【关键词】 促红细胞生成素;Aβ25～35;PC12细胞;凋亡

　　阿尔茨海默病(AD)是老年人最常见的神经变性疾病，临床表现为进行性痴呆、认知障碍和行为异常。促红细胞生成素(EPO)是由胚胎肝脏和成人肾脏分泌的一种低分子糖蛋白，调节红细胞的生成。然而EPO的功能并不仅限于此，EPO及其功能受体在中枢神经系统中也有表达，但其作用机制尚未完全明了。Lu等〔1〕研究发现，EPO可增强大鼠外伤性脑损伤后的神经发生，使齿状回新生神经元数量增多,空间记忆功能恢复加快;此外，EPO 可诱导脑源性神经生长因子的表达，对其诱导的神经前祖细胞的存活和分化具有重要的意义。Lee 等〔2〕研究发现，EPO可调节神经干细胞分化为多巴胺能神经元或星形胶质细胞。EPO 能增强胚胎皮层神经元的生存能力，促进细胞存活，增强神经前祖细胞的增殖。Morishita等〔3〕在体内细胞培养中发现EPO 可抑制谷氨酸诱导的神经细胞死亡,显示出EPO对神经细胞具有保护作用。但EPO对AD的作用却少有报道，本实验采用Aβ25～35诱导PC12细胞损伤建立AD的细胞模型,从细胞水平探讨EPO对AD的保护作用,为EPO在AD治疗中的应用提供新的依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　PC12细胞(中山大学干细胞中心),兔抗人Bcl2单克隆抗体(北京中杉生物公司)，EPO (美国Sigma公司)，Aβ25～35(美国Sigma公司)，兔抗细胞色素C(CytC)多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA USA.)，SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、1640培养液、胎牛血清、 马血清 (Gibco)，MTT(美国Sigma公司)。

　　1.2 仪器

　　超净工作台、CO2孵箱( 美国)，酶标仪、倒置相差荧光显微镜(日本Olympus 产品)。

　　1.3 细胞培养

　　PC12细胞用15%1640 培养，按1×104/ml密度接种到培养瓶，于37℃、5% CO2孵箱中培养，2 d换液1次。细胞为上皮样贴壁生长,每4～5天用0.25%胰蛋白酶消化传代1次,取对数生长期细胞用于实验。

　　1.4 溶液的配制

　　Aβ25～35的“老化”处理:将1 mg 的Aβ25～35溶解于1 g/L三氟乙酸溶液943 μl中，终浓度为1 mmol/L,于37℃下孵育7 d左右,即为“老化”状态。

　　1.5 实验模型的建立及分组

　　选取生长良好的PC12细胞分为三组,第1组为正常对照组:1640培养液培养细胞。第2组为Aβ25～35诱导的PC12细胞组:同时加入培养液和Aβ25～35，Aβ25～35终浓度为10 μmol/L。第3组为EPO+ Aβ25～35处理组：加入培养液和EPO,进行MTT检测时EPO的浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 U/ml，然后选择MTT结果最理想的一组进行下一步检测。EPO预处理细胞8 h后加入10 μmol/L Aβ25～35损伤，继续培养48 h后进行指标检测。

　　1.6 MTT检测

　　取对数生长期PC12细胞以1.0×104个细胞/ml密度，每孔100 μl接种于96孔板上,置于37℃、5% CO2孵箱中培养。药物保护组分别加入不同终浓度(100、50、25、12.5、6.25 U/ml) EPO预处理8 h，再与模型组同时加入10 μmol/L Aβ25～35,继续培养48 h。检测时每孔加入MTT(5 g/L)33 μl,继续培养4 h,弃上清,每孔加入150 μl DMSO,震荡10 min后,酶标仪570 nm波长下自动测OD值。细胞存活率(%) =用药组细胞OD /对照组细胞OD×100%。

　　1.7 免疫细胞化学法检测Bcl2蛋白和CytC的表达

　　将1 cm×1 cm大小的盖玻片置于24孔板中,每孔以2×104/ml细胞密度接种,以制作细胞爬片。4%多聚甲醛液固定30 min后,用PBS清洗3次,每次3 min,5% Triton X100 37℃，作用15 min，PBS洗3次。加入内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min,用PBS清洗3次;加入1%BSA孵育10 min,甩干后加入一抗(兔抗小鼠CytC多克隆抗体1∶100,兔抗大鼠Bcl2多克隆抗体1∶100),阴性对照加PBS,置于4℃冰箱过夜;PBS清洗3次后加入HRP标记的二抗,置室温下30 min，PBS清洗3次;除去PBS液,滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，室温下孵育20 min，PBS清洗3 次;加入DAB显色5 min，PBS清洗终止反应,苏木精复染。光镜下观察,随机计数每8个高倍镜下(×200)阳性染色细胞数及细胞总数,计算细胞阳性染色的百分数。

　　1.8 PI单染

　　将对数生长期的PC12细胞以2×106个/ml接种于6孔板,每孔加2 ml液体培养24 h,药物保护组加入终浓度为25 U/ml的EPO预处理8 h,再与模型组组同时加入终浓度为10 μmol/L Aβ25～35,继续培养48 h。收集细胞至1.5 ml EP管中。1Buffer A洗涤细胞一次(离心2 000 r/min,5 min)，收集并调整细胞浓度为1×106/ml;细胞加9倍体积的70%乙醇于-20℃固定至少12 h;离心后收集细胞用1Buffer A洗涤细胞以除去乙醇，细胞重悬于500 ml 1Buffer A的中。加入RNaseA,使其终浓度为0.25 mg/ml,37℃,反应30 min;加入5 μl PI染液,室温避光染色30 min;流式细胞仪检测。

　　1.9 统计学方法

　　采用SPSS 10.0统计软件,数据以x±s表示,三组间总体均数的差异用方差分析,组间样品均数的差异用LSDt检验。

　　2 结果

　　2.1 MTT实验结果

　　对照组存活率为100%,与正常对照组相比,Aβ25～35处理组存活率为76%,显著降低(P<0.05)，活细胞数较少;EPO处理组(100、50、25、12.5、6.25 U/ml)存活率依次为84%、90%、110%、95%、92%(P<0.05)，EPO处理组活细胞数增多，并且EPO中剂量组活细胞最多，超过一定的剂量后随着剂量增加，细胞存活率下降。实验表明EPO可以拮抗Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤，具有显著的保护作用。

　　2.2 免疫组化Bcl 2表达

　　正常组PC12细胞中有少量Bcl2的表达，Bcl2蛋白的阳性表达为胞浆内黄褐色或者棕黄色颗粒，Aβ25～35处理组阳性表达减少，EPO处理组可见大量Bcl 2阳性细胞，较Aβ25～35处理组明显增加,空白对照组未见阳性染色。对各组阳性细胞进行计数,正常组:(102.27±9.45)个/高倍视野，阳性染色率为87%;Aβ2535处理组:(23.80±6.24)个/高倍视野，阳性染色率为23%;EPO组:(112.08±11.94)个/高倍视野，阳性染色率为93%。模型组Bcl2蛋白阳性表达水平与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05),模型组与EPO处理组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

　　2.3 PI单染

　　模型组细胞凋亡率为11.62%，而对照组凋亡率为1.95%,两者差异有统计学意义(P<0.05);EPO组(25 U/ml EPO + 10 μmol/L Aβ25～35) 细胞凋亡率为4.21%，较模型组下降7.41%(P<0.05),差异有统计学意义，说明EPO可以抵抗Aβ25～35引起的PC12细胞凋亡。

　　2.4 免疫组化CytC表达

　　正常组PC12细胞可见散在CytC阳性染色细胞，Aβ25～35处理组胞浆中CytC免疫反应性明显增多，EPO处理组CytC阳性染色细胞明显减少。对各组阳性细胞进行计数,正常组:(38.27±8.45)个/高倍视野，阳性染色率为27%;Aβ25～35处理组:(97.80±9.08)个/高倍视野，阳性染色率为75%;EPO组:(35.08±8.34)个/高倍视野，阳性染色率为23%。各组之间均有统计学意义(P<0.05)。空白对照未见阳性反应细胞。见图2。

　　3 讨论

　　目前发现Aβ与细胞凋亡关系密切,Aβ可分别由凋亡基因表达及凋亡相关酶活性改变、促进自由基产生、钙离子平衡紊乱、线粒体功能紊乱、NFκB激活等多途径诱导细胞凋亡,参与AD的发生和发展。其中第25～35位氨基酸构成的肽，体外水溶液中可形成稳定的聚集,呈β片层状二级结构,具有神经毒作用,常用作体外神经毒实验的AD模型〔4〕。

　　PC12细胞为大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞克隆化的细胞株,具有典型神经嵴源性和神经细胞特点,PC12细胞被作为一种良好的神经系统体外模型,用于研究多种神经系统疾病,如AD、帕金森病等,并且PC12细胞上存在大量的EPO受体。本文以PC12细胞为研究材料,成功复制了Aβ25～35诱导的神经细胞毒性的模型,探讨EPO对神经细胞毒性的保护作用。

　　EPO是重要造血因子，近年研究发现神经系统也存在，并且EPO通过与受体结合引起一系列的信号转导，对体外细胞培养、脑发育、对一些脑的疾病发挥一定的作用。研究报道外源性EPO能减轻脑和脊髓的缺血和外伤、蛛网膜下腔出血、癫痫持续状态和实验性变态反应性脑脊髓炎等导致的神经元损伤，提示EPO具有广谱的神经保护作用〔5〕。外源性EPO对神经细胞有显著的保护作用,本实验提示EPO受体具有一定的饱和性,EPO应用超过一定剂量可减弱其保护作用。EPO对PC12细胞有保护作用，可降低PC12细胞的凋亡率,抑制Aβ25～35诱导的细胞核固缩、核碎裂、核溶解。

　　为进一步研究其可能机制,我们以免疫组化对抗凋亡基因Bcl2和CytC的蛋白表达水平进行检测,结果发现EPO预处理使Aβ25～35诱导PC12细胞Bcl2免疫反应阳性细胞增多,CytC免疫反应阳性细胞较模型组明显减少。近年来发现CytC在细胞凋亡处于核心地位，CytC是水溶性小分子物质,位于线粒体内,是线粒体呼吸链的基本组成部分。CytC注入细胞可诱导细胞凋亡,释放入胞浆的CytC可与凋亡相关因子1(Apaf1)结合,裂解caspase9 使其活化，活化的caspase9 再通过裂解激活caspase3，进入内源性和外源性凋亡途径的最后通路,诱导凋亡〔1〕。免疫组化技术可检测到释放到胞浆中的CytC〔6〕。凋亡过程中CytC的释放是线粒体外膜通透性增高的结果。关于CytC释放的具体机制，有两种途径：①各种损伤因素如腺苷浓度降低、无机磷酸盐、氧自由基、pH 改变或膜电位降低等都可触发膜通透转运孔开放，导致CytC的释放;② Bcl2 家族蛋白形成通道，调控CytC的释放。在线粒体细胞凋亡通路的上游途径,Bcl2 家族主要作用为维持线粒体膜的完整性,抑制线粒体通透性转变和CytC等凋亡蛋白的释放,从而阻止细胞凋亡〔7〕。结合本实验结果可认为EPO抑制细胞凋亡机制可能为上调Bcl2蛋白表达，维持线粒体膜的稳定性，阻止CytC从胞浆的释放，对Aβ25～35诱导PC12细胞有保护作用。

　　【参考文献】

　　1 Lu D，Ma A，Qu C,et al.Erythropoietin enhances neurogenesis and restores spatial memory in rats after traumatic brain injury〔J〕. Neurotrauma,2005;22(9):10117.

　　2 Lee SM，Nguyen TH，Park MH,et al.EPO receptormediated ERK kinase and NFkappaB activation in erythropoietin promoted differentiation of astrocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004;320(4):108795.

　　3 Morishita E，Masuda S，Nagao M,et al.Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons，and erythropoietin prevents in vitro lutamate induced neuronal death〔J〕. Neuroscience，1997;76(1):10516.

　　4 Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science，2002;297(5580)：3536.

　　5 Maiese K，Li F，Chong ZZ,et al.New avenues of exploration for erythropoietin〔J〕.JAMA，2005;293(1):905.

　　6 van Beekarmsen BJ，vander Laarse WJ.Immunohistochemical determination of cytosolic cytochrome C concentration in cardiomyocytes〔J〕. Histochem Cytochem,2005;53(7):8037.

　　7 Orrenius S.Mitochondrial regulation of apoptotic cell death〔J〕.Toxicol Lett,2004;149(123):1923.