结缔组织生长因子表达水平与垂体腺瘤侵袭性之间关系

垂体腺瘤是颅内常见良性肿瘤,约占颅内肿瘤10%~15%[1]。按生物学行为可分为垂体癌、非侵袭性与侵袭性垂体腺瘤(IPA),IPA约占垂体腺瘤的10%~35%[2]。高恒[3]对侵袭性垂体腺瘤目前治疗现状进行了总结,认为手术是侵袭性垂体腺瘤的主要治疗方法,但由于肿瘤所侵袭结构的复杂性,导致全切率低,复发率高[4]。IPA的发病机制及综合治疗成为近年研究热点之一。所以寻找侵袭性垂体腺瘤新的生物治疗靶点显得尤为重要。结缔组织生长因子(CTGF)是一种富含半胱氨酸的分泌多肽,属于即刻早期基因,分子量为36~38kD,有研究证实它与肿瘤的发生、发展密切相关,CTGF加速DNA合成、促进细胞增殖[5],促进新生血管形成[6]。Ladwa R[7]等报道,CTGF在结肠癌的发生、发展中起着重要作用;在乳头状甲状腺癌中CTGF表达水平与肿瘤细胞的增殖和对化疗药物耐药性呈正相关;Xc D[9]等发现乳腺癌中CTGF在mRNA水平高表达,且与肿瘤大小、淋巴结转移和临床分级显著相关。本文选取2011年2月至2012年6月在哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科收治的68例患者,探讨CTGF在侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤中的表达差异,进而为侵袭性垂体腺瘤生物学诊断和治疗提供理论基础。

1材料与方法

1,1一般资料本组男40例,女28例,平均年龄46.22岁。依据Wilson改良Hardy分类系统分级分期标准分组[10]:侵袭性垂体腺瘤52例,非侵袭性垂体腺瘤16例。术前均有MRI诊断,且未经过放疗、化疗或药物治疗。全部病例经手术切除肿瘤,并经病理确诊为垂体腺瘤。

1.2主要试剂与仪器TRIZOL Rcagcnt(USA);逆转录试剂盒;Realtimc PCR MerMk(日本TaKaRa产品);Tanon凝胶成像系统;兔抗人CTGF多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥生物技术有限公司)、β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);ECL显影试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司);八连管(青岛艾科宝生物科技有限公司);PCR仪(ABI 9700);:夹F时劳拦±妻PCR仪(ABI 7500);Nalloclro1。ND-10O0分光光度计。

1.3提取总RNA和逆转录PCR取30mg垂体腺瘤组织,研磨,加人11tll TRIZOL Reagent。依照TRIZOL Rcagcnt说明书步骤,完成提取总RNA。将RNA溶于20ul RNase-cc水中。使用Nan。drop ND-1000分光光度计检测总RNA浓度。每一病例标本`总RNA的%O/280nm比值在1,8~2.0之间。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为单链cDNA。20llll逆转录反应体系中,包含1ug总RNA。反应条件:9~s℃,10min;37℃,120min;85℃,5s;4℃,+∞。

1.4 Rcal-time PCR将逆转录PCR产物cDNA,稀释10倍。稀释后的cDNA lul分别加入2×Rea1-time PCR MasterMix4uL,上、下游引物各0.5ul,去离子水2ul,总反应体系为8ul。将不同反应体系置于%孔板内,在T~sOOHT荧光定量PCR仪上进行PCR扩增并行荧光定量,检测CTGF和内参基因β-actin的扩增情况。反应条件为:%℃,1min,呖℃,15s及60℃,60s,共硐个循环。所用引物序列见表1[11]。

1.5 We虻em bl矾每一标本分别取10mg垂体腺瘤组织,研磨,加人~sO tll RIPA细胞裂解液,反复吹打后置冰浴~sOmin,120OCl1·/而n,4℃离心3Omin,取上清,应用Iolvlv法测定蛋白浓度。取蛋白20帽做SDS扌AGE电泳,将蛋白样本转移至PⅤDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2h,PB叩洗2次,每次1min。加入兔抗人CTGF多克隆抗体(1∶2000)、兔抗人β-诫in抗体(1∶5OO0),4℃孵育过夜。次日,PB叩洗4次后(每次5min),加人辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶50O0),室温摇床摇1h;PBsT洗4次(每次5min)。ECL法显色,Tan。n凝胶成像系统拍照,并同时进行灰度分析(CTGF灰度值/β-achn灰度值;每个样本重复三次,取平均值)。

1,6统计学分析统计方法用sP“13.0软件包处理数据。实时定量PCR所得数据用均数±标准差(mean±SD)表示。组间差异比较采用非配对莎检验进行分析,以P(0.∞表明具有统计学差异,P<0.01时认为有显著统计学差异。

2结果

2.1 Rcal-time PCR经mRNA定量表达结果分析:I6例非侵袭性垂体腺瘤和52例侵袭性垂体腺瘤中CTGF的mRNA水平上表达有显著性差异(P=0.0Ol),见(图2,表2)。

2.2 Weern bl结果Tdl·c,n凝胶成像系统拍照,灰度分析。将所得结果进行样本均数莎检验发现:CTGF的表达水平与肿瘤侵袭性显著相关(P=0.OO1),与肿瘤直径大小相关(P<0.O5),与年龄、性别和垂体腺瘤激素类型无相关性(表3,图3)。

3讨论

1940年,Jeffcrsc,ll首先提出:IPA是指结节样生长且容易侵犯周围结构的垂体腺瘤。侵袭性垂体腺瘤的诊断主要根据临床影像学检查和手术中所见。IPA组织学证实为良性,而生物学行为具有恶性特点,但叉缺乏垂体癌的组织学及转移的证据,因此属于介于良恶性之间的交界性肿瘤。

造成肿瘤侵袭性生长的原因目前还不十分清楚。手术是IPA的主要治疗方法。IPA术后不仅并发症多,且易复发,不得不依赖辅助性放射治疗和药物治疗。术中损伤下丘脑更是造成术后严重并发症甚至危及生命的直接原因。术后常见的并发症(脑脊液漏、垂体功能低下、尿崩症、神经血管损伤、术区出血等)可危及患者生命,也严重影响患者生存质量,因此寻找侵袭性垂体腺瘤新的治疗靶点成为了关注的重点。CTGF为CCN(Cy1、CTGF和nt,v)家族的重要成员,在成人心、脑、肝、肺、肾等多种组织和器官中均有表达。CTGF具有丝裂原性,刺激细胞增生、分化、胚胎发育、血管生成、创伤修复、瘢痕形成、动脉粥样硬化、肝、肺、肾纤维化,并且和肿瘤的发生、发展密切相关。相关文献报道,CTGF在胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤中高表达[叨4]。采用基因芯片技术检测发现,在能诱发前列腺癌的间质组织中CTGF表达较正常前列腺间质组织明显高,CTGF高表达的间质组织中的微血管密度相应较高且移植瘤的生长速度也较快。在Edm。ndson分级Ⅲ~Ⅳ级的肝细胞癌组织中CTGF表达量明显高于I~Ⅱ级的肝癌组织,同时有静脉浸润的肝癌组织中CTGF基因表达较无静脉浸润表达高,且与肿瘤级别、瘤体大小、淋巴结转移情况和年龄显著相关。在脑胶质瘤中,CTGF表达水平与胶质瘤的侵袭性和恶性程度呈正相关。说明CTGF在胶质瘤的侵袭、发展中可能起着重要作用。CTGF可能是诱发和促进垂体腺瘤侵袭性生长的重要调控因子之一。

采用Realte PCR方法对16例非侵袭性垂体腺瘤和52例侵袭性垂体腺瘤标本检测发现:mRNA水平上,侵袭性垂体腺瘤CTGF表达量较非侵袭性垂体腺瘤高,且具有统计学意义(P=0.0O1),这提示CTGF mRNA与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。蛋白水平,CTGF在侵袭性垂体腺瘤中表达量高于非侵袭性垂体腺瘤(P=0.OO1),说明CTGF在垂体腺瘤的侵袭过程中起着重要作用。垂体腺瘤直径大小与CTGF蛋白表达量正相关(P=0.O5);McBP等人认为垂体腺瘤的侵袭性随着肿瘤直径的增大而增加[19],结合我们的实验结果,这间接证明了垂体腺瘤直径大小与CTGF表达正相关。CTGF促进垂体腺瘤侵袭性发生和发展的作用机制尚未阐明,已有研究证实CTGF和血管生成有密切联系[20],cTGF可通过上调促进肿瘤细胞增殖。我们考虑CTGF在IPA中的作用机制可能是:CTGF改变肿瘤及周围间质的微环境如促进微血管生成有关。肿瘤的侵袭性和转移与新生血管的形成和血供的丰富程度呈正相关。总之,我们研究发现CTGF在侵袭性垂体腺瘤的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤,在临床上检测垂体腺瘤组织中CTG凡的表达水平,有助于侵袭性垂体腺瘤诊断。同时CTGF与垂体腺瘤侵袭性密切相关,在这一方面CTGF有可能成为侵袭性垂体腺瘤生物学治疗的靶点。

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