人用DBS系统在脑深部电刺激猴模型构建中的应用

脑深部电刺激(DBS)目前是治疗中晚期帕金森病首选的外科治疗方法,可以缓解帕金森病的运动症状,具有安全性高、可逆、可调节的优点[1],并且有研究表明丘脑底核脑深部电刺激可以提高纹状体区多巴胺的代谢[23],并且具有一定的神经保护作用。但DBS的作用机制目前仍不完全清楚,还需要进一步深人研究[4]。动物模型可以提供良好的研究平台,目前已经有的基础研究中大多数采用短暂刺激,而将电刺激系统植人动物体内进行长期慢性电刺激的研究仍然较少。曾有学者将DBS系统植入猴PD模型体内进行DBS的基础研究[5],但是由于动物专用的DBS系统来源困难,难以普及和推广。所以本研究对人用DBS系统在猴体内的植入,构建脑深部电刺激模型中的应用进行探讨。

1资料与方法

1.1动物分组实验动物采用恒河猴4只,均为雄性,10岁龄以上,平均体重8.2kg。动物随机分为2组,刺激组植入整套DBS系统,而对照组仅植人电极,不植人脉冲发生器。

1,2猴偏侧PD模型的制备4只猴均采用血管内介入方法在右侧颈内动脉注入1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)(0.8mg/kg美国⒊gma公司),制各猴偏侧PD模型[7]。术后对猴进行行为学观察和猴偏侧PD模型运动障碍评分(DRSH)。猴逐渐出现左侧肢体活动减少、肌张力增高等PD样症状,阿朴吗啡(AP0)(0.2mg/kg)肌肉注射可诱发向左侧的自发旋转运动(>7圈/min),证实猴偏侧模型制备成功,观察3个月未出现PD症状自动恢复的情况,为下一步实验做好动物准备。

1.3人用DBS系统植人人用脑深部电刺激系统(美国)由三部分组成即3389型脑深部刺激电极、7495型连接导线和7426型脉冲发生器。首先将猴头部固定于日本成茂SN-2型立体定向仪头架上。根据猴脑立体定向图谱[9](芝加哥大学出版社1961年出版),确定右侧STN的靶点坐标参数(A9.0mm,R4.3mm,D1.5mm)。调整确定各坐标参数后将3389型脑深部刺激电极固定于立体定向仪,并在校正仪上校对参数无误后,缓慢将电极插人至预定靶点。骨孔处用医用耳脑胶封闭,骨窗周围预先固定钛钉两枚,用牙科水泥将电极固定。刺激组猴同期在背部作一袋状囊,将铆笳型脉冲发生器埋人皮下,与头部切口处作一皮下隧道,将铆95型连接电极和脉冲发生器。在脑深部电极植入术后行X线及MRI检查以明确电极位置。MRI检查前先关闭脉冲发生器,以防脉冲发生器损坏。

脉冲发生器植人术后一周内处于关机状态,并每日给予抗生素,(头孢拉定0,笏g肌肉注射1/d)连续3d,背部及头部切口每日进行观察,如发现有明显皮下积液,进行抽吸和胶布加压包裹。此时对动物进行行为学观察,一周后打开脉冲发生器,进行刺激参数的调整。在常用参数(脉宽ω~120ms,频率130~Ig~s Hz,电压2.5~3.5Ⅴ)的基础上,选择脉宽ω¨、频率130Hz不变,电压由1.0Ⅴ开始逐渐增加,以0.1V为一个单位,最高电压为3.0伏。由于33⒆型脑深部刺激电极头端有4个触电,分别进行不同触点的单触点单极刺激和双触双极刺激测试点。在不同的触点和刺激参数下观察猴运动情况,结合AP0诱发旋转试验确定最适合的刺激参数,以自发性的旋转立即停止表示有效。排除有肢体抽搐、惊叫、肢体蜷缩等副作用情况下选择电压最小的参数作为最佳有效刺激参数。然后进行慢性高频电刺激,连续12个月的观察。观察期间按照实验设定的时间节点进行DRsH评分,每次评分前进行开关机的AP0诱发旋转实验以验证猴偏侧PD模型的有效性,偏侧PD症状有无自发缓解。在12个月的观察期结束后,处死动物,取猴脑进行大脑病理学和组织学检查。

2结果

2.1人用DBS系统植人4只猴右侧STN立体定向成功植入DBS电极,术后MRI检查证实电极的前端均在叩N范围内(图1),刺激电极的4个触`点清晰可见。在电极近脑皮层处,有局部脑组织水肿,电极前端周边脑组织也有轻度水肿,1个月后复查MRI电极周围脑组织水肿消失。刺激组2只猴同期皮下植人脉冲发生器及连接导线。术后查X片检查提示电极及脉冲发生器均在预定位置,电极在颅内无明显弯曲及位移,连接导线与脉冲发生器在皮下无脱落折断等(图2)。对照组仅植人电极,电极在局部头皮下固定,未连接脉冲发生器。术后一周内猴头部切口愈合良好,其中刺激组猴M1背部埋置脉冲发生器的部位在术后出现了积液,经反复抽吸,加压包扎,一周后积液完全吸收,对脉冲发生器未造成不良影响。

2.2最佳刺激参数在有效的刺激参数下猴对侧肢体的帕金森样症状明显缓解,左侧肢体活动明显增多,趴伏动作减少,步态稳定。在AP0诱发旋转实验中开机既可立即终止自发的旋转运动c分别在开、关机状态下经行为学观察和阿朴吗啡实验证实单触点单极电刺激较双触电双极刺激更加有效,有效刺激参数范围在脉宽ωms、频率130HZ、电压1.5~2.0Ⅴ之间,AP0诱发旋转运动在开机时完全消失,没有出现其他的副作用。在有效的触点电极刺激时过高的电压会引起猴痉挛、恐惧、抽搐等副作用,在叩N核范围以外的触点给予较高电压时可有症状的部分缓解,但是同时会引起肢体痉挛、趴伏、暴躁等副作用。因此,最后刺激组猴M1选用触点3、脉宽ωms、频率1⒛Hz、电压1.7Ⅴ作为刺激参数,猴M2选用触点2、脉宽ωms、频率130Hz、电压I,5Ⅴ为刺激参数。

2,3脑深部电刺激猴模型的运动学评估和DRSH评分4只猴植入电极后第3d开始均出现了不同程度的对侧肢体的运动功能暂叫勹眭改善,DRSH评分降到了3~4分,这种改善状态仅保持了2d左右后又再次加重,至第5d左右恢复至6~7分,在第7 d基本恢复至术前的状态。在打开脉冲发生器后,刺激组猴的帕金森样症状立刻得到明显的好转,DRSH评分迅速降至2~3分,在随后的⒓个月内的各观察时间点分别进行评分和测试,刺激组动物的评分维持在3分左右,而对照组动物评分保持在7~8分,APO实验证实猴偏侧帕金森病模型有效,症状无明显自行缓解征象。

2.4组织病理学检查在观察12个月后,4只猴处死后取脑组织,灌流固定后开颅后将脑组织完整取出,对照解剖图谱,沿电极方向冠状和横断位切开脑组织,发现电极均准确位于预定靶点位置(图3),电极前端位于丘脑底核内。HE染色光镜可见电极针道内可见少量变性坏死的空泡细胞以及淋巴细胞浸润(图4)。引N核内电极前端与正常侧比较周边可见轻度胶质细胞增生(图5)。

3讨论

日前脑深部电刺激成为治疗以帕金森病为代表的一些神经功能性疾病的有效治疗手段,但是由于脑深部电刺激技术的应用和发展均是建立在临床观察的基础上,对于脑深部电刺激的机理还有很多未知数:动物模型是进行基础研究的有利武器和必各的实验平台,由于脑深部电刺激的治疗是一个长期而慢性的过程,所以如果将电极刺激系统植人动物体内,可以对动物模型进行长期慢性高频电刺激研究,将使DBS的研究更加符合临床的实际情况,研究的结果也将更加准确。目前关于DBS的动物实验研究所用的高频电刺激均为临时刺激,体内植入电刺激系统制各动物模型进行长期电刺激研究的报道很少。

目前已经有学者将DBS系统植入猴PD模型体内进行DBS的基础研究[5],但是由于动物专用的D"系统来源困难,价格高昂。因此,本研究以DBS在猴偏侧PD模型脑深部电刺激中的应用为基础,将人用DBS系统植入猴体内进行12个月的长期慢性高频电刺激。对人用DBS系统在构建脑深部电刺激模型中的应用、对模型的制作方法/植入后的动物模型评估进行了研究。

本实验采用了美国美敦力(Medtronic USA)公司DBS治疗系统,包括3389型脑深部刺激电极、7495型连接导线和⒌1etra TM,ZI⒛型脉冲发生器。这套系统中的3389型电极直径为1.27mm,前端有4个触点,每个触点1.5mm,触点间隔0.5mm,有效刺激区域可达到7.5mm。型脉冲发生器可以提供单侧电极或双侧电刺激,刺激的参数可以由程控仪在体外进行调整。

在临床上我们通常采用局麻状态下为患者植人电极,在术中利用体外临时脉冲发生器给予电刺激确定疗效良好后,再改为全麻状态植入整套DBS装置。有时也可以进行分期手术,在反复观察调整刺激参数确认疗效后再植人脉冲发生器。但动物实验研究要在猴自由活动的状态下观察猴PD样症状的改善情况,体外临时脉冲发生器无法使用,所以在研究中DBS系统采用了一期植人。根据猴立体定向图谱,确定猴脑内靶'点坐标参数,植入电极后将电极固定在颅骨上。电极的固定采用了钛连接片结合牙科水泥的固定方法,在观察时间里未见到有电极的松动。脉冲发生器的植人通常选择一侧背部肩胛骨上方,这样可以有效的避免猴对伤口和设各的抓挠而导致DBS系统损坏或电极的移位、断裂。

由于电极的直径为1.27mm,触点为l.5mm,触点间隔为0.5mm,所以这就要求脑内植入的靶点选择不能小于(1.5×2.0)mm2,否则电极本身的体积的占位效应将对靶点造成严重的损伤。本研究所选择的猴脑内STN核大小为(3.5×3.0×15)mm3,根据实验结果至少有1到2个触点在叩N核团内,这样可以采用单触`茕单极给予有效刺激。目前已经有按照脑体积比例制各的脑深部电极刺激系统应用于动物模型研究中[5‘l,并且有学者对动物所用的电极材料进行了研究,认为含铁质的电极不宜使用[10]。由于猴脑的体积远较人小,目前在MRI和CT下定位使用的人用立体定向头架无法使用,而目前常规使用的动物用立体定向头架又无法在MRI和CT机上匹配使用。但由于图谱与实际实验动物在物种和头颅体积大小等方面的差异,靠经验来判断靶点位置参数的修改数值,也可能带来一定的误差。在本研究中发现有些电极整体位置较深,而有些又略浅,但由于3389型电极的有效刺激范围可达7.5mm,足以弥补猴脑体积大小差异所带来的误差。另外微电极电生理定位可以作为一种电极植入后的辅助定位手段,根据不同核团的电生理信号的不同而确定核团的范围,目前已经有学者将微电极靶点定位应用到动物模型的制作中[6]。但电生理定位也有一定局限性,由于猴脑核团体积较小,并且在全身麻醉的状态下区分细微的电生理变化将会有很大的困难,也存在一定的误差,因此此种方法也仅作为一种辅助定位手段,利用电生理技术进行实验动物脑内靶点的确认和定位还需要进一步的研究和探索。

我们认为AP0诱发旋转实验结合行为学观察可以有效地进行电刺激参数的调整和观察,根据旋转行为的停止和症状的改善来确定刺激参数的有效性。这比单纯根据观察PD样症状来调节刺激参数节省了大量的时间,可以快速而有效的确定有效刺激参数的范围,缩短了实验的时间,同时也避免了在非有效刺激参数状态下长时间的调整和刺激导致的不良副作用和并发症。长期的DRSH评分可以有效的监测猴PD脑深部电刺激模型的有效性。而AP0诱发旋转实验则可以验证PD偏侧症状有无自发性的缓解,通过这两项评估,我们可以有效的监测脑深部电刺激模型长期的有效性,从而保证实验结果的准确和可信。本研究在猴处死后进行了猴脑的组织病理学研究,根据组织病理学结果看,人用DBS电极在猴脑内的植人在电极周边可以观察到少量的坏死细胞和淋巴细胞浸润,以及胶质细胞增生外,并没有观察到STN核神经元细胞的大量破坏,这也证实了体积较大的电极在猴脑内靶点中的可应用性。

通过立体定向技术同期将DBS系统植人动物体内可以建立长期慢性高频电刺激的动物模型,为探讨DBS的作用机制,DBS治疗神经疾病的适应症、禁忌症、长期的疗效和副作用等基础研究,提供了良好的实验基础。

[参考文献]

[1]Sharma A,Szeto K,Desilets AR.Efficacy and safety of deep brain stimulation as an adjunct to pharmacotherapy for the treatment of Parkinson disease[J].Annals of Pharmacotherapy,2012.248.

[2]周晓平,刘汉华,顾靖.丘脑底核电刺激对猴偏侧帕金森病纹状体神经递质的影响[J].中华神经外科杂志,2006.714.

[3]曹依群,周晓平,胡小吾.丘脑底核脑深部电刺激治疗帕金森病的功能显像实验研究[J].第二军医大学学报,2005.174.

[4]Deniau JM,Degos B,Bosch C.Deep brain stimulation mechanisms:beyond the concept of local functional inhibition[J].European Journal of Neuroscience,2010.1080.

[5]Elder CM,Hashimoto T,Zhang J.Chronic implantation of deep brain stimulation leads in animal models of neurological disorders[J].Journal of Neuroscience Methods,2005.11.

[6]Gao DM,Benazzouz A,Piallat B.High-frequency stimulation of the subthalamic nucleus suppresses experimental resting tremor in the monkey[J].Neuroscience,1999.201.

[7]Collier TJ,Steece-Collier K,Kordower JH.Primate models of Parkinson's disease[J].Experimental Neurology,2003.258.

[8]Gomez-Mancilla B,Bédard PJ.Effect of nondopaminergic drugs on L-dopa-induced dyskinesias in MPTP-treated monkeys[J].Clinical Neuropharmacology,1993.418.

[9]Snider R S,Lee J C.A stereotaxic atlas of the monkey brain(macaca mulatta)[M].Chicago,USA.the university of Chicago press,1961.A10.5-AA7.0.

[10]Gimsa J,Habel B,Schreiber U.Choosing electrodes for deep brain stimulation experiments-electrochemical considerations[J].Journal of Neuroscience Methods,2005.251.