泼尼松与促皮质素致未成熟脑损伤机制的初步探讨
发表时间：2009-07-08 浏览次数：798次
王晓宇,曹 洁,蔡方成 (重庆医科大学附属儿童医院神经内科,重庆400016) 摘 要:目的 对泼尼松与促皮质素导致脑损伤的机制进行初步探讨。方法 婴幼大鼠(7日龄)和成年大鼠(2月龄)各192只,分为泼尼松婴幼组、泼尼松成年组、促皮质素婴幼组和促皮质素成年组共4个大组(n=96),每大组再分为长、短程治疗剂量组以及相应用药后停药4周组,长、短程小剂量组以及相应用药后停药4周组,及对照组等共计12个观察组(n=8)。对各组血清中NSE水平、脑内Bax与Bcl-2蛋白表达以及神经细胞进行检测。结果 短、长程治疗剂量给予婴幼鼠泼尼松或促皮质素后,血清神经元特异性烯醇化酶(Neuro-specific Enolase,NSE)水平较对照组显著升高,其幅度达50. 6% ~103. 2%;长程小剂量给药后其增高幅度为38. 3% ~60. 3% (P>0. 05),但这些NSE升高的组同时伴有Bax蛋白表达显著增强(P<0·01)、Bax/Bcl-2比值增高(1. 91~2. 40倍之间)和TUNEL阳性细胞表达的增多。而成年鼠仅在治疗剂量泼尼松或促皮质素长程给药后见血清NSE及免疫组化、TUNEL等各项指标有显著异常。停药4周后,婴幼鼠或成年鼠各组的各项指标与对照组相比均不再有显著差异。结论 过度凋亡与坏死过程的激活是导致婴幼期激素脑损伤的重要机制。 关键词:泼尼松;促皮质素;未成熟脑;大鼠 中图法分类号:R-332;R743. 802;R977. 11文献标识码:APathogenesis of brain damage in infant rats induced by corticosteroidsWANG Xiao-yu,CAO Jie,CAI Fang-cheng(Department of Neurology,Children’s Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China) Abstract:Objective To explore the possible pathogenesis ofbrain damage in rats induced by prednisoneor corticotrophin.Methods The doses of prednisone or corticotrophin were determined by a primary experi-ment to obtain corresponding plasma cortisol or corticosterone level as same as that in sick children after drugtaking. Then 192 healthy infant(at the age of7 d)and 192 adult(at the age of2months)male SD ratsweredivided into 4 groups as infantprednisone group,adultprednisone group,infantcorticotrophin group and adultcorticotrophin group(n=96 in each). then every group was further subdivided into 12 subgroups(n=8 ineach). The subgroupswere divided according to the dose(therapeutic or low doses),the course[short(10 d)or long(3 weeks)],the sacrificed time(24 h or4 weeks afterwithdrawal),and their corresponding controls.Serum neuron-specific enolase(NSE)concentrationwas quantified byELISA. Expressions ofapoptosis-relatedproteins,Bax and Bcl-2 in the brainwere detected by immunohistochemical assays. Neuronal apoptosiswas de-tected byTUNEL.Results Ourprimary experiment indicated that the therapeutic dosewas4mg·kg-1·d-1or 150U·m-2·d-1forprednisone orcorticotrophin,and the smalldosewas2mg·kg-1·d-1or38U·m-2·d-1for them. In infant rats treated with prednisone or corticotrophin at therapeutic-dose for short or longterm,their serum NSE concentrationwere increased significantly by 50. 6% to 103. 2%. And serum NSE wasincreased by 38. 3% to 60. 3% in infantafter low-dose treatment for long term. Over-expression ofBax protein(P<0·01),increase ofBax/Bcl-2 ratio(1. 91 to 2. 40 times)and more TUNEL-positive neurocyte were de-tected in these above groups. In adultgroups only those treated with therapeutic-dose prednisone or corticotro-phin for long term displayed above mentioned features.Conclusion Excessive apoptosis and initiation ofprocess death are the importantmechanism ofbrain damage induced by prednisone or corticotrophin. Key words:prednisone;corticotrophin;immature brain;rats 治疗哮喘、婴儿痉挛等儿科疾病常需要中、长期使用肾上腺皮质激素。早在20世纪80年代,影像学即发现婴儿痉挛患儿经激素治疗后出现脑萎缩[1]。其他疾病治疗中也有类似报道[2],如Yeh等[3]发现早产儿接受地塞米松治疗后会导致头围减小。Merke等[4]发现大剂量糖皮质激素导致库欣综合征的患儿存在脑萎缩。哮喘儿童经糖皮质激素治疗1年后出现认知能力下降和反应速度减慢[5, 6]。但这些患者几乎都存在各种基础性疾病,临床上很难排除这些因素的干扰,独立地研究激素对脑发育的影响,更不可能在健康婴幼儿身上进行用药观察。本研究以健康大鼠为实验对象,对激素导致脑损伤的相关机制进行初步探讨,为进一步探索该损伤的防治措施提供实验依据。1 材料与方法1. 1 激素大鼠模型剂量的选定 先经预实验测得10例患儿,重庆医科大学附属儿童医院同期住院患儿(2岁以下,无内分泌系统相关疾患,连续服用2 mg·kg-1·d-1治疗剂量泼尼松5 d以上)的血清皮质醇浓度,其平均值为正常儿童的15. 79%。分别以0、2、3、4 mg·kg-1·d-1剂量泼尼松加赋型剂(0. 5%羧甲基纤维素钠)对24只7 d龄雄性SD婴幼鼠(4组,n=6)清晨8: 00灌胃连续7 d,第8天清晨将动物麻醉后取血,测得4 mg·kg-1·d-1剂量将使皮质酮浓度抑制为正常值的15. 17%,接近前述临床测试值15·79%。故确认4 mg·kg-1·d-1为匹配临床婴儿用药的治疗剂量组用量,又取其半量,即2 mg·kg-1·d-1作为婴幼鼠小剂量组用量。对照组给予赋形剂0. 5%羧甲基纤维素钠,给药方式为每日药量清晨1次灌胃。 在预实验中,我们以3. 8、38、150 U·m-2·d-13个不同剂量促皮质素分别对大鼠腹腔注射,发现30 min后其皮质酮水平均达同一峰值,升高程度与促皮质素剂量无关。因而确认将临床治疗婴儿痉挛的促皮质素最大剂量150 U·m-2·d-1和最小剂量38 U·m-2·d-1 [7]直接作为本研究促皮质素的治疗剂量和小剂量组用量。对照组给予生理盐水,给药方式为每日药量分2次腹腔注射。1. 2 实验动物及分组 清洁级健康SD雄性大鼠384只,按照动物年龄与给药种类分为泼尼松婴幼组(7 d龄, 13~18 g)、泼尼松成年组(2月龄, 180~220 g)、促皮质素婴幼组和促皮质素成年鼠组,共计4个大组(n=96)。以泼尼松婴幼组为例,按照给药的剂量大小、疗程长短以及观察时间的不同,再分为12个小组(n=8)。其余3个大组的分组与泼尼松婴幼组类似,也分别被分为相似的12个观察组。长疗程组给药时间为3周,短疗程组给药时间为10 d。1. 3 标本收集 分别于停药后24 h或停药后4周清晨8: 00予乙醚吸入并追加10%水合氯醛3 ml/kg麻醉大鼠,经股动脉取血后将大鼠断头处死,快速解剖分离出完整大脑, 4%多聚甲醛固定,再分别切取含额叶皮层以及视交叉与乳头体间海马组织标本。将所取血清静置1 h后以3 000 r/min速度离心10 min并分离血清, -20℃冻存备用。1. 4 血清NSE检测和脑切片免疫组化检测 ELISA法(检测试剂盒购自北京福瑞生物工程公司,使用美国Humareader公司生产的全自动酶标仪进行检测)测血清神经元特异性烯醇化酶(Neuro-specific Enolase,NSE)含量。按照试剂盒说明书进行操作。以光密度值D(488)为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据样品光密度值D(488)在标准曲线上查出各样品浓度。 免疫组织化学方法检测脑组织凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达(兔抗大鼠Bcl-2单抗、兔抗大鼠Bax单抗、DAB显色试剂盒、即用型SABC免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司)。按照SABC免疫组化试剂盒说明书进行操作。分别在海马CA3区、大脑额叶对应区域各取5个视野(20×10倍),应用北航CM-2000B型生物医学图像分析系统测定其平均光密度。 原位末端标记(TdT-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)法检测凋亡神经细胞(原位细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司)。按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。荧光显微镜下(激发波长为488 nm)观察细胞染色情况。1. 5 统计学处理 采用SPSS 11. 5统计软件。计量资料以-x±s表示,采用双侧显著性检测,多组之间比较采用单因素方差分析。2 结果2. 1 血清NSE变化 连续10 d短程给药后,仅在婴幼鼠(泼尼松及促皮质素)的治疗剂量组血清NSE均值有显著增高,分别高于对照组50·62%与57. 34% (P<0·05)。其余婴幼组及成年组的NSE值无明显改变。3周长程给药后,婴幼鼠泼尼松及促皮质素治疗剂量组NSE值增高更明显,其均值较对照分别增高达103·23%与100. 04% (P<0·01),成年鼠治疗剂量组仅有轻度增高,超过对照66. 81%与60. 40% (P<0·05)。表明激素诱导的神经元坏死过程因年龄和疗程不同而显示明显差异(表1)。 无论短程或长程给药,停药4周后,婴幼及成年鼠各组血清NSE值均较对照组无显著性差异,表明激素引起的脑损伤过程在停药4周后处于基本静止。2. 2 脑片Bcl-2和Bax蛋白的表达 Bcl-2和Bax免疫组化光密度半定量分析显示:短程给予泼尼松或促皮质素后,婴幼鼠各组额叶皮层及海马Bcl-2蛋白表达与对照组相比均无显著差异,仅在泼尼松及促皮质素的治疗剂量组有Bax蛋白表达显著增加(P<0·01),伴Bax/Bcl-2比值明显升高,其比值在额叶分别为相应对照组的1·99倍与2·00倍(1. 215vs0. 610, 1. 297vs0. 648),在海马皮层分别为1. 91倍与2. 29倍(1. 409vs0. 738, 1. 457vs0·637)。而成年鼠各组的Bcl-2、Bax及Bax/Bcl-2比值均无明显改变(表2、3,图1A、B)。 接受长程治疗剂量泼尼松或促皮质素后,婴幼鼠及成年鼠的额叶及海马皮层Bcl-2蛋白表达与对照组相比依然无显著性差异。然而,与短程用药不同之处是长程用药后,不仅是治疗剂量,而且小剂量的泼尼松或促皮质素,也将引起婴幼鼠额叶及海马皮层Bax蛋白表达的显著增高(P<0·1), Bax/Bcl-2比值亦升高至对照组的1. 92倍至2. 40倍间。而成年鼠仅在两药的治疗剂量长程给药后,海马皮层Bax蛋白表达出现显著增加(P<0·01),伴Bax/Bcl-2比值明显升高。不仅提示海马皮层可能较额叶对激素的脑损伤作用更敏感,同时也再次显示长疗程激素会更加激活脑内的细胞凋亡进程(表4、5,图1C)。 停药4周后,无论婴幼鼠或成年鼠,所有组额叶及海马皮层的Bax、Bcl-2蛋白表达与对照组均不再有明显差异,说明即使长疗程用药,停药4周后激素对各年龄鼠脑内Bax与Bcl-2蛋白的表达亦不再有持续影响(图1D)。2. 3 给予不同疗程不同剂量激素后脑片TUNEL阳性细胞的表达 短程给予泼尼松或促皮质素后,仅在婴幼鼠的治疗剂量组额叶和海马皮层可见较对照组明显增多的TUNEL染色阳性细胞,伴荧光亮度显著增强。其余各组与对照组均无明显差异。长程给药后,婴幼鼠的小剂量组和治疗剂量组额叶及海马皮层均可见显著增多的TUNEL染色阳性细胞。而成年鼠仅在长程治疗剂量泼尼松或促皮质素给药下,海马皮层有TUNEL阳性细胞的明显增多(图2A、B、C)。无论短程或长程用药,停药4周后,两年龄组额叶和海马皮层的TUNEL染色结果与正常对照组均无明显差异(图2D)。3 讨论 糖皮质激素对婴幼儿脑发育可能造成的不良影响早已受到广泛关注。然而,临床病例观察都不可避免地存在疾病过程影响,难以确认在发生的脑损伤中有多大程度直接与激素治疗相关,为此,本实验选用健康动物进行观察。发现给予婴幼鼠短程治疗剂量、长程治疗剂量或长程小剂量泼尼松或促皮质素后,HE和染色观察可见额叶皮层和海马有明显神经细胞变性坏死表现。给予成年鼠长程治疗剂量的泼尼松或促皮质素后,可见海马有明显的神经细胞变性坏死表现。而停药4周后,无论大鼠的年龄以及给药的种类、剂量与疗程如何,神经细胞的病理改变均不再明显。在此基础上本实验对激素导致脑损伤的机制进行了初步探讨。 NSE特异性存在于神经元和神经外胚层组织中,是当前公认的神经元损伤坏死的特异性生物学指标[8]。在有关促皮质素和糖皮质激素导致脑损伤机制的文献中,鲜见有激素与血清NSE水平相关性的观察报道。本研究表明给予泼尼松或促皮质素后,有明显组织学损伤的实验组血清NSE水平增高,证实神经元坏死也是激素脑损伤的重要机制之一。有关激素导致神经元坏死的机制尚不清楚,有研究显示[9],糖皮质激素使已受损的海马神经元代谢障碍因而促使其坏死。对体外培养的神经元进行的实验亦证实[10],激素可通过加速神经元的ATP消耗使神经元对损伤的易感性大大增加。 从本研究各组脑片TUNEL染色的对比观察中,还证实了激素脑损伤中的另一重要机制———神经细胞的过度凋亡。Bcl-2家族是凋亡调控机制中最重要的蛋白家族,其中, Bcl-2分子具有抗凋亡作用, Bax也为Bcl-2家族成员,但功能与Bcl-2相反,是促凋亡分子,干扰细胞内Ca2+的稳态浓度,激活caspase-12,从而促进凋亡发生[11]。Bax/Bcl-2的比值可反映细胞凋亡的发展趋势。本研究中所有发生明显凋亡过程的实验组,均存在Bax蛋白表达和Bax/Bcl-2比值的明显增高,Bcl-2却相对无改变,表明Bax表达增强可能是本研究中激素启动神经细胞凋亡过程的重要因素。meida等[12]对体外培养神经细胞进行研究,发现糖皮质激素受体激活可使胞内肿瘤抑制因子p53水平上调,后者促使Bax蛋白表达增高[13, 14],进而诱导凋亡发生。 本研究通过多角度的交叉对比分析显示,在临床用药剂量范围内,泼尼松和促皮质素均易引起婴幼期大脑,尤其海马皮层神经细胞的凋亡与坏死,且这2种损伤随疗程延长而进行性加重。然而,无论短程或长程给药,停药4周后脑内均不再继续有凋亡和坏死征象。因而,本实验结果认为停用激素4周后,将不再有活动性的激素脑损伤。 本研究对激素脑损伤机制的探索发现如下规律:①年龄依赖性。婴幼鼠较成年鼠脑内有更明显凋亡、坏死过程;②剂量依赖性。治疗剂量组引起的凋亡、坏死过程大多比小剂量组明显;③疗程依赖性。无论激素的种类与剂量,也无论婴幼鼠或成年鼠,长程给药后导致的脑损伤多比短程给药后更为明显。④损伤过程的自限性。停药后无论大鼠的年龄或激素种类及疗程,脑内均不再有继续过度凋亡与坏死的明显证据;⑤通过对比观察显示,成年鼠在长程治疗剂量给药后,仅发现海马皮层有明显的神经细胞凋亡,表明海马皮层较额叶的神经细胞对激素的脑损伤作用有更大敏感性。这些规律与本研究对于激素所导致的脑组织病理学损伤的规律完全吻合,而且在前期组织病理学研究中发现有明显组织学损伤的实验组,在本研究中也显示有NSE的更明显升高和TUNEL阳性细胞增多,充分说明激素所诱导的凋亡与坏死是激素导致脑损伤的重要机制。
参考文献:[1] GlazeD G, HrachovyR A, FrostJD Jr.,etal. Computed tomographyin infantile spasms: effects of hormonal therapy[J]. PediatrNeuro,l1986, 2(1): 23-27.[2] Parikh N A, Lasky R E, Kennedy K A,et al. Postnatal dexametha-sone therapy and cerebral tissue volumes in extremely low birth weightinfants[J]. Pediatrics, 2007, 119(2): 265-272.[3] Yeh T F, Lin Y J, LinH C,etal. Outcomes at school age afterpost-natal dexamethasone therapy for lung disease ofprematurity[J]. N En-gl JMed, 2004, 350 (13): 1304-1313.[4] MerkeD P, Giedd JN, KeilM F,etal. Children experience cognitivedecline despite reversal of brain atrophy one year after resolution ofCushing syndrome[J]. JClin EndocrinolMetab, 2005, 90(5): 2531-2536.[5] Kohler-ParisA, PeyriereH, VincentD. Inhaled corticoids and system-ic secondary effects: controversies[ J]. Allerg Immunol (Paris),2002, 34(9): 333-336.[6] Dickstein G, SpigelD, Arad E,et al. One microgram is the lowestACTH dose to cause a maximal cortisol response. There is no diurnalvariation of cortisol response to submaximalACTH stimulation[J]. EurJEndocrino,l 1997, 137(2): 172-175.[7] HrachovyR A, Frost J D Jr., Glaze D G. High-dose, long-durationversus low-dose, short-duration corticotropin therapy for infantilespasms[J]. J Pediatr, 1994, 124(5 Pt1): 803-806.[8] KannerA A, MarchiN, FazioV,etal. Serum S100beta: a noninva-sivemarkerofblood-brain barrier function and brain lesions[J]. Canc-er, 2003, 97(11): 2806-2813.[9] SapolskyRM. Glucocorticoid toxicity in the hippocampus: reversalbysupplementation with brain fuels[J]. JNeurosc,i 1986, 6(8): 2240-2244.[10] Wang J, ChambersG, Cottrell JE,etal. Differential fall inATP ac-counts foreffectsof temperature on hypoxic damage in rathippocampalslices[J]. JNeurophysio,l 2000, 83(6): 3462-3472.[11] ZongW X, LiC, HatzivassiliouG,etal. Bax and Bak can localize tothe endoplasmic reticulum to initiate apoptosis[ J]. J Cell Bio,l2003, 162(1): 59-69.[12] AlmeidaO F, CondeG L, Crochemore C,etal. Subtle shifts in theratio between pro-and antiapoptoticmolecules after activation of corti-costeroid receptors decide neuronal fate[ J]. FASEB J, 2000, 14(5): 779-790.[13] ZhangL, Nie L, MakiC G. P53 and p73 differ in their ability to in-hibitglucocorticoid receptor (GR) transcriptional activity[ J]. MolCancer, 2006, 5: 68.[14] TodorovicV, Chen C C, Hay N,et al. The matrix protein CCN1(CYR61) induces apoptosis in fibroblasts[ J]. J Cell Bio,l 2005,171(3): 559-568.
