神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤AQP4及GFAP表达的影响
发表时间：2009-09-11 浏览次数：594次
神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤AQP4及GFAP表达的影响 李琴1张红1毕明俊2郭云良3梅元武1* （1华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科， 武汉 430030； 2荣成市第二人民医院外二科， 荣成 264309；3青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所， 青岛 266003） 摘要 应用线栓法经颈外颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）大鼠动物模型，经颈内动脉单剂量注射1.5% 神经调节素1β（NRG1β，0.3 μg/kg )干预治疗。用干湿重法、免疫组化、免疫荧光双标记法和免疫印迹法观察NRG1β对大鼠脑缺血再灌注损伤水通道蛋白（AQP4）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。结果显示：随着缺血时间延长，对照组脑组织含水量逐渐增加，NRG1β治疗能减少MCAO/R后脑组织含水量，与对照组相比，缺血1.5~2.0 h组存在显著性差异（P<0.05）。脑缺血再灌注损伤可诱导脑组织AQP4及GFAP表达，且随着缺血缺氧时间的延长，AQP4及GFAP蛋白的表达逐渐增加。尽管它们均在胶质细胞中表达，但在脑组织中的分布略有不同。NRG1β治疗可以增加二者在脑中的表达水平，与对照组相比具有显著性差异（P<0.01）。以上结果提示，NRG1β可能通过激活内在的保护机制，增强胶质细胞的活性，从而抑制MCAO/R早期脑水肿的形成过程，改善神经元的生存环境，进而干扰脑缺血再灌注损伤的病理生理过程，对缺血性脑损伤具有积极的保护作用。 关键词 神经调节素脑缺血再灌注损伤AQP4GFAP免疫荧光双标染色免疫印迹法 Influence of neuregulin on the expressions of AQP4 and GFAP in brain of rats following cerebral ischemia/reperfusion Li Qin1, Zhang Hong1, Bi Mingjun2, Guo Yunliang3, Mei Yuanwu1 (1Department of Neurology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030;2The Second Department of Surgery, The Second People’s Hospital of Rongcheng, Rongcheng 264309; 3Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003) Abstract The animal models of middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) were established by monofilament method from the externalinternal carotid artery in rats. A single dosage of 1.5％ neuregulin1β（NRG1β，0.3 μg/kg) was injected from the internal carotid artery (ICA) for treatment. The drywet weight compare, the immunohistochemical and immunofluorescent double staining and Western blotting assay were used to determine the impact of NRG1β on the expressions of aquaporin4 (AQP4) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) following cerebral ischemia/reperfusion. The results showed that the brain water content increased in the control group with the duration of ischemia. NRG1β treatment decreased the parameter. Compared with that in the control group, there were significant differences between the two groups at ischemia 1.5~2.0 h（P<0.05）. Cerebral ischemia/reperfusion injury induced the expressions of AQP4 and GFAP in brain tissue and the alternations of the two proteins gradually elevated along with the increased ischemia time. Though the two proteins located mainly in glia, their distributions slightly varied in brain regions. The administration of NRG1β could increase the expressional level of AQP4 and GFAP. Significant differences were found as compared with that in the control group (P<0.01). These results suggest that NRG1β might inhibit the formation of early cerebral edema after MCAO/R, improve the microenvironment of neuron survival through activating the intrinsic protective mechanism and the glia function, further disturb the pathophysiological process and play a protect role in ischemic cerebral insult. Key wordsneuregulin, cerebral ischemia and reperfusion injury, AQP4, GFAP, immunofluorescent double assay, Western blot 星形胶质细胞在生理和病理条件下，可调节水和离子渗透平衡，帮助清除激活的神经元周围过高的K+，以确保适当的神经元外环境。星形胶质细胞水肿是机体在多种状态下发生的一种共同现象，与脑损伤密切相关［1］。AQP4介导由渗透梯度改变引起的快速水转运，可导致原代培养的星形胶质细胞体积改变，参与了脑缺血、脑创伤、脑肿瘤继发的脑水肿的发生发展过程［2, 3］。神经调节素1β（neuregulin1，NRG1β）是上皮生长因子酪氨酸激酶受体家族（ErbB）的激动剂，可能在脑缺血再灌注损伤过程中具有神经保护作用［4］。本研究拟通过观察NRG1β治疗后MCAO/R大鼠脑组织内AQP4及GAFP表达的变化，旨在探明脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞在脑水肿形成中的作用及NRG1β的神经保护机制，为临床应用提供理论依据。 材料和方法 1.动物模型的建立和干预治疗健康雄性Wistar大鼠165只，体重240~260 g，SPF级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供【SCXK（鲁）20030010】。动物于实验前置于实验室适应环境一周，自由进食、饮水；室温控制在(23±2)℃，自然光照。随机选择15只作为假手术组，其余应用线栓法经左侧颈外颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型，动物苏醒后左侧出现Horner征，提尾右前肢屈曲或爬行向右侧划圈为模型成功的标志［5］。将150只成功的MCAO/R动物模型随机分为对照组和治疗组(n=75)，然后根据缺血时间每组再分为缺血0、0.5、1.0、1.5、2.0 h五个亚组(n=15)，再灌注时间均为24 h。假手术组除不插线拴外，其余手术步骤相同。 应用0.1 mol/L的 PBS将重组人NRG1β（R & D Systems, Inc., Catalog number: 396HB）溶解稀释成1.5%溶液，治疗组动物分别于缺血0、0.5、1.0、1.5、2.0 h拔除线栓后，即刻以微量注射器经颈外动脉颈内动脉给予1.5% NRG1β ( 0.3 μg/kg )，然后结扎颈外动脉残端，放开颈总和颈内动脉的动脉夹恢复血流再灌注。对照组同步注射同等剂量0.1 mol/L的 PBS，假手术组不做处理。 2.脑组织含水量（BWC）测定各组在相应时间点取5只动物，断头完整取脑，切除前端的嗅球和后部的小脑和脑干，沿大脑正中线切开，取左侧半脑组织标本，用JA2300N型电子分析天平(精密度1/10 000 g)称量湿重，然后置100℃红外线干燥箱内烘干48 h至恒重，再称干重。BWC＝（湿重－干重）/湿重×100％。 3.制备石蜡切片及免疫组化检测各组在相应时间点取5只动物，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，依次用生理盐水、含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）各200 ml经心脏灌注固定后断头取脑，置于上述相同固定液中后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方开始连续冠状位切片，厚度6 μm，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，4℃保存备用。AQP4及GFAP单克隆抗体购自Santa Cruz公司，即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB染液购于武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书染色步骤操作，即：切片常规脱蜡，梯度酒精水化。微波修复两次，依次滴加正常动物血清封闭液（室温孵育20 min），稀释的一抗（AQP4和GFAP单抗稀释度均为1∶100，4℃孵育过夜），生物素化二抗IgG （37℃，20 min）， SABC（37℃，20 min），DAB显色。光镜下观察胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。阴性对照切片不加一抗，用0.01 mol/L的PBS代替，未检测到阳性反应。每只大鼠取4张连续切片，在400倍光镜下观察皮质区、纹状体区及海马区，并随机取4个视野，用Leica Qwin图像处理与分析系统（Leica公司）分析各个视野的吸光度值（A）。 4.免疫荧光组织化学双标染色 免疫荧光组织化学双标染色检测前，将同一组织连续4张切片分别进行AQP4和GFAP染色，其中每种染色分别使用不同的显色方法，如加入AvidinFITC，用488 nm波长的蓝色激光激发FITC，在510~530 nm下接收，此时FITC发出绿色荧光；或加入AvidinCy3，用568 nm波长的绿色激光激发Cy3，在600~650 nm下接收，此时Cy3发出红色荧光。根据着色情况选择着色深的AQP4（AvidinFITC显色）定义为首先显色的一抗，GFAP（AvidinCy3）第二次显色。具体步骤：石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、微波修复后，加入非免疫性动物血清封闭液（1∶10）封闭20 min、AQP4一抗（1∶200），37℃孵育2 h，生物素标记的二抗（1∶100）和AvidinFITC（1∶100）37℃各30 min；然后依次加入GFAP一抗（1∶200）、相应二抗（1∶100）和AvidinCy3（1∶100），PBS水洗后用防蜕变水性封片剂封片，直接在荧光显微镜下观察。整个过程注意避光操作，PBS充分水洗，以免荧光褪色或残留过多荧光杂质。 5.Western blotting各组在相应时间点取5只大鼠，麻醉大鼠后快速断头取脑，并置液氮中快速冷冻，-70℃保存备用。取脑组织100 mg提取总蛋白。制备SDSPAGE凝胶，加样电泳。采用半干转法转膜。将PVDF膜分别浸入含10％脱脂奶粉TBST的封闭液（室温封闭l h）、TBS配制一抗稀释液（AQP4和GFAP稀释度均为1∶300，4℃过夜）、HRP标记的二抗稀释液(羊抗兔IgG 1∶2 000，北京中山公司，室温2 h)。最后将膜置于X光片盒中，曝光2～4 min，显影40 s，定影2 min，水洗5 min。每一步骤注意充分水洗，避免非特异性染色。将采用BioRad 2 000型凝胶成像系统扫描光片后，应用Quantity one软件进行吸光度分析。以同一标本3磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH)的光密度值作为内参，校正各自目的蛋白的积分光密度值，并按公式(相对A值=AQP4或GFAP表达强度/GAPDH表达强度)计算出相对值。 6.统计学处理采用SPSS11.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较用方差分析，两组均数间比较用t检验。结果 1.脑组织含水量用干湿重法测定，假手术组和缺血0 h组脑组织含水量为（78.13±0.48）%，对照组和治疗组脑缺血后可引起脑组织含水量的增加，随缺血时间的延长，脑水肿程度逐渐加重。与假手术组和缺血0 h组相比，对照组在缺血1.5~2 h有统计学差异（P<0.05)；与对照组相比，NRG1β治疗组在缺血2.0 h时段，脑含水量显著降低（P<0.05，表1）。2.脑缺血后AQP4的表达免疫组化染色结果显示：假手术组和缺血0 h组脑组织中可见少量淡染的棕黄色AQP4阳性细胞，胞体形态不规则，散在分布于大脑皮质、纹状体和海马各区。缺血缺氧可以诱导AQP4的表达。随着缺血时间的延长，缺血侧脑组织AQP4阳性细胞逐渐增多，颜色逐渐增强。与假手术组和缺血0 h组相比，缺血1.0~2.0 h组AQP4阳性细胞数显著增加（P<0.05）。NRG1β治疗可增加AQP4的表达水平，阳性细胞着色明显增强，与对照组相比有统计学差异（P<0.01，表2，Fig.1A~C）。免疫荧光组织化学染色结果显示：假手术组和缺血0 h组AQP4阳性细胞呈浅绿色荧光，形态不规则，阳性颗粒在细胞中分布不均匀，在细胞浆及突起中均有表达。主要分布于双侧脑组织的星形胶质细胞，特别是靠近蛛网膜下腔、位于血管周围的星形胶质细胞表面和星形胶质细胞的终足紧密包绕毛细血管壁形成的一层胶质界膜上表达强烈，但在少数神经元中也可见到AQP4免疫阳性细胞。随着缺血时间的延长，缺血侧脑组织AQP4阳性细胞逐渐增多，大量AQP4蛋白流入细胞核内（Fig.2A, D）。Western blotting结果显示：缺血0 h组双侧大脑半球均可出现AQP4免疫阳性条带，但灰度值极低，双侧比较无统计学差异（P>0.05）。缺血再灌注可诱导脑组织AQP4蛋白的表达，随着缺血时间的延长，双侧大脑半球AQP4蛋白的灰度值逐渐升高，但以缺血侧更为显著，与缺血0 h组相比，缺血1.0~2.0 h组存在显著差异(P<0.01）。NRG1β可增加AQP4的表达水平，与对照组相比存在显著差异（P<0.01, Fig.3A）。 3.脑缺血后GFAP蛋白的表达免疫组化染色结果显示，假手术组与缺血0 h 组脑组织中可见少量淡染的棕黄色GFAP阳性细胞，胞体形态不规则，有多个短至中等长度的突起，延伸至脑组织各层，散在分布于大脑皮质、纹状体和海马各区。对照组随着缺血时间延长，皮质区、纹状体区和海马各区阳性细胞逐渐增多，着色加深，A值升高。NRG1β治疗后，GFAP的表达水平较对照组相应区域明显增加（P<0.05，表3，Fig.1D~F）。 免疫荧光双标结果显示：假手术组与缺血0 h组脑组织中均可见少量淡染的GFAP阳性细胞。对照组脑组织GFAP阳性细胞呈红色荧光，胞体形态不规则，有多个短至中等长度的突起延伸至脑组织各层，GFAP阳性颗粒分布在胞浆、胞核及突起中。主要分布在缺血侧的皮质区、纹状体区和海马各区。随着缺血时间延长，阳性细胞逐渐增多，着色加深，与缺血0 h相比，0.5~2.0 h存在显著差别（P<0.05）；治疗组GFAP的表达水平较对照组明显增加，尤其是0.5、1.0和1.5 h组，2.0 h组次之（P<0.05，Fig.2B, E）。Western blotting结果显示：缺血0 h组双侧大脑半球脑组织均出现GFAP免疫阳性条带，灰度值很低。缺血再灌注可诱导脑组织GFAP蛋白的表达，随着缺血时间的延长，双侧大脑半球GFAP蛋白的灰度值逐渐升高，但以缺血侧更为显著，与缺血0 h组相比，缺血1.0~2.0 h组存在显著差异（P<0.01）。NRG1β可增加GFAP的表达水平，与同一时间点对照组相比，存在显著差异（P<0.01, Fig. 3B）。4.脑缺血后AQP4和GFAP的关系免疫荧光双标结果显示：AQP4和GFAP阳性细胞均散在分布于大脑组织各区，形态不规则，尽管都位于胶质细胞中，且随着缺血时间的延长，它们的表达水平逐渐增加，但二者在脑组织中的分布位置和表达水平明显不同，AQP4主要分布于脑表面的脑膜和脑室系统等处的胶质界膜上，在星形胶质细胞中表达强烈，阳性细胞突起相对少，紧密包绕在毛细血管壁上。而GFAP阳性细胞散在分布于脑组织各区，有多个短至中等长度的突起，延伸至脑组织各层，部分GFAP阳性细胞也显示出AQP4免疫阳性（Fig.2C, F），说明尽管AQP4和GFAP在细胞内的分布位置有所差异，但在同一时间点二者的表达水平存在相关性（P<0.01，表4）。 讨论 AQP4是一种水通道蛋白，广泛存在于中枢神经系统中，不但构成胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础，而且与脑脊液分泌、重吸收、电解质和渗透压调节等生理过程密切相关。研究表明，AQP4基因敲除鼠较野生型鼠相比，星形细胞足突的膨胀程度较轻，缺血24 h后组织含水量下降约35%，神经功能缺损症状明显减轻，说明AQP4参与了脑挫伤、炎症、脑血管病所引起的一系列脑水肿病理过程［6, 7］。Satoh等［8］报道，培养的人星形胶质细胞可以同时表达AQP1和AQP4，缺血缺氧后的脑组织匀浆中可检测到二者表达水平的增高，而且二者的表达水平与GFAP相关；缺血缺氧后高度表达AQP1和AQP4的星形胶质细胞具有长的分支，围绕在血管壁上，或者形成纤维胶质疤痕，但是巨噬细胞、神经元或者少突胶质细胞却没有AQP1和AQP4免疫阳性，说明缺血缺氧后脑组织AQP1和AQP4的表达增强主要定位于星形胶质细胞，AQPs在维持中枢神经系统水平衡方面具有重要作用。Frydenlund等［9］认为，尽管血管周围星形胶质细胞膜上的AQP4参与了脑水肿的形成和消退过程，但是不同的脑区AQP4的表达模式明显不同，在纹状体核心区再灌注24 h，血管周围AQP4表达水平明显下降，而且以后也没有恢复的趋势。在缺血受累最重的皮质区，也可表现为血管周围AQP4的明显减少，与纹状体区核心区相似，但再灌注72 h后AQP4的表达水平有部分回升。在皮质周围带AQP4的表达不但没有明显的减少，而且还有轻微的升高。说明在不同的脑缺血再灌注阶段，AQP4在脑水肿形成和消退中能够调控脑组织和血液之间的体液交换。Suzuki等［10］认为，AQPs和血管内皮生长因子（VEGF）可能在脑水肿形成和消退中起重要作用，AQP1，AQP4和VEGF能过共同表达在GFAP阳性的胶质细胞中，AQP1和AQP4在星形胶质细胞的终足部位表达强烈，主要定位于水肿的脑组织中，部分包绕在脑毛细血管周围，从而调节缺血缺氧后脑组织水的流入和渗出。本实验结果显示，缺血缺氧后可以引起脑组织含水量的增加，组织含水量的高低与缺血时间和脑梗塞面积密切相关，这一结果与Chen等［11］的结果相似。AQP4的表达水平随着缺血时间的延长逐渐增高，并在中枢神经系统中具有明显的区域选择性，大多数阳性细胞紧密包绕在毛细血管壁上，在少数神经元上也可见到微弱阳性表达。这一结果与Taniguchi等［12］和周仁兰［13］的结果相似，但与Frydenlund等［9］的结果略有差异。我们分析，AQP4介导的水跨细胞膜的转移是缺血后继发性脑水肿液体清除的关键，在脑水肿形成和消除的不同时期具有不同的作用，脑梗死早期（<2 h），AQP4水平的升高可能是机体自我保护作用，从而维持细胞内外的液体平衡；但随着缺血缺氧程度的加重（>24 h），AQP4水平进一步升高，可能促进了脑水肿的形成和发展，即具有双向调节作用，但具体机制尚需深入探讨。本实验结果还显示，部分星形胶质细胞同时表达AQP4和GFAP免疫阳性，缺血缺氧后二者的表达水平均明显升高，且具有相关性，说明AQP4和GFAP蛋白可存在于同一个胶质细胞中。GFAP表达增强是星形胶质细胞的增生、发育和功能活跃的一个直接证据，反映了星形胶质细胞对神经元损伤的适应性改变。它可能降低细胞外兴奋性氨基酸，参与构成受损部位神经元生存的微环境，对受损部位神经元的存活、突起的再生和神经系统功能的恢复有重要的影响，具有较持久的神经保护作用［14］。我们推测：缺血缺氧能够诱导星形胶质细胞胶质化，进而激活部分细胞中AQP4蛋白的活性，早期AQP4表达增高是胶质细胞的适应性反应，可降低细胞内、外的渗透压梯度，使渗透性物质进一步流入胶质细胞，导致细胞体积的增大。后者反过来可激活体积敏感性有机渗透物/阴离子通道，介导有机渗透性物质的外流，对抗细胞的肿胀［15］。因此，星形胶质细胞可能通过GFAP和AQP4的共同作用介导水跨膜的双向运动，从而影响缺血缺氧后脑水肿的形成和消退。但并不是每个AQP4阳性细胞都能同时表达GFAP的免疫阳性，说明AQP4在缺血缺氧性脑损伤中的作用可能是不同的，这种适应性的神经保护作用可能通过那些同时表达GFAP和AQP4蛋白的胶质细胞而实现的，而只表达GFAP或AQP4的阳性细胞未必具有类似的功能。NRG1β被认为与神经元的生存和功能有关，可能通过多种机制，如调节两种抗凋亡分子Bcl2和Bclw的表达［4］，抑制单核细胞浸润和星形胶质细胞活化［16］，抑制血管内皮上的单核黏附分子和趋化因子的产生、诱导巨噬细胞凋亡或促进细胞存活的磷脂酰肌醇3激酶/Akt信号转导通路等［17］发挥神经保护作用。本研究表明，NRG1β处理后AQP4和GFAP蛋白表达水平明显升高，说明NRG1β可诱导星形胶质细胞的反应性增殖，活化AQP4蛋白，在脑水肿急性期及时抑制AQP4介导的水内流，而在脑水肿形成后积极加速AQP4介导的水外流，从而改变神经细胞生存微环境，为改善神经元功能起到积极的保护作用，也将成为减轻缺血性脑水肿的理想策略。但具体作用机制仍需进一步探讨。 参考文献 ［ 1］ 张志军, 吴利平, 万群 等. 缺血再灌注对大鼠神经元与星形胶质细胞的影响. 神经解剖学杂志, 2005;21:611-614［ 2］ 唐玲, 胡长林. 实验性缺血性脑水肿AQP4 表达的动态观察. 中华神经科杂志, 2004;37:579-581 ［ 3］ Papadopoulos MC, Manley GT, Krishna S et al. Aquaporin4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema. FASEB J, 2004;18:1291-1293 ［ 4］ Xu ZF, Ford BD. Upregulation of erbB receptors in rat brain after middle cerebral arterial occlusion. Neurosci Lett, 2005;375:181-186 ［ 5］ 刘豪, 李琴, 毕明俊 等. 肌苷对大鼠脑缺血再灌注后钙调神经磷酸酶和环氧合酶2表达的影响. 中国康复医学杂志, 2004;19:839-842 ［ 6］ Kiening KL, van Landeghem FK, Schreiber S et al. Decreased hemispheric Aquaporin4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats. Neurosci Lett, 2002;324:105-108 ［ 7］ 付雪梅, 封志纯. RNA干扰介导新生大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4基因沉默. 中国循证儿科杂志, 2006;1:279-282 ［ 8］ Satoh J, Tabunoki H, Yamamura T et al. Human astrocytes express aquaporin1 and aquaporin4 in vitro and in vivo. Neuropathology, 2007;27:245-256 ［ 9］ Frydenlund DS, Bhardwaj A, Otsuka T et al. Temporary loss of perivascular aquaporin4 in neocortex after transient middle cerebral artery occlusion in mice. Proc Natl Acad Sci USA, 2006;103:13532-13536 ［10］ Suzuki R, Okuda M, Asai J et al. Astrocytes coexpress aquaporin1, 4, and vascular endothelial growth factor in brain edema tissue associated with brain contusion. Acta Neurochir Suppl, 2006;96:398-401 ［11］ Chen CH, Xue R, Zhang J et al. Effect of osmotherapy with hypertonic saline on regional cerebral edema following experimental stroke: a study utilizing magnetic resonance imaging. Neurocrit Care, 2007;7:92-100 ［12］ Taniguchi M, Yamashita T, Kumura E et al. Induction of aquaorin4 in water channel mRNA after focal cerebral ischemia in rat. Brain Res, 2000;78:131-37 ［13］ 周仁兰, 谢鹏, 罗天友 等. 大鼠脑缺血后水通道蛋白4的表达与脑梗死异常代谢物相关性分析. 中国脑血管病杂志, 2005;2:355-359 ［14］ Briones TL, Woods J, Wadowska M et al. Astrocytic changes in the hippocampus and functional recovery after cerebral ischemia are facilitated by rehabilitation training. Behav Brain Res, 2006；171:17-25 ［15］ Nicchia GP, Nico B, Camassa LM et al. The role of aquaporin4 in the bloodbrain barrier development and integrity:studies in animal and cell culture models. Neuroscience, 2004;129:935-945［16］ Liu D, Smith CL, Barone FC et al. Astrocytic demise precedes delayed neuronal death in focal ischemic rat brain. Brain Res Mol Brain Res, 1999;68:29-41 ［17］ Li BS, Ma W, Jaffe H et al. Cyclindependent kinase5 is involved in neuregulin dependent activation of phosphatidylinositol 3kinase and Akt activity mediating neuronal survival. J Biol Chem, 2003;278:35702-35709
