颅内动脉瘤信号传导相关基因的筛选

作者：石忠松,李明昌,孙毅明作者单位：（ 1. 中山大学附属第一医院神经外科， 广东 广州 510080; 2. 广州医学院第二附属医院神经外科， 广东 广州 510260 ）

        【摘要】  　　【目的】 基因芯片技术建立颅内动脉瘤患者血液单核细胞基因表达谱，筛选与信号传导相关的基因表达情况。【方法】 50例颅内动脉瘤患者外周血，10例正常成人作为对照组，分离血液单核细胞，提取总RNA，与含22 215个人类基因的Affymetrix寡核苷酸基因芯片杂交、洗脱、染色和扫描，分析检测的数据。荧光定量RT-PCR验证芯片结果。【结果】 检测的22 215个基因中，颅内动脉瘤共差异表达的基因有325个，差异水平均达2倍以上的基因有35个，生物信息学分析发现信号传导相关基因有7个，其中上调基因5个，下调基因2个。【结论】 血液单核细胞基因表达谱是研究颅内动脉瘤发病机制的新策略，多个信号传导相关基因参与颅内动脉瘤的形成和发展。

【关键词】  颅内动脉瘤; 白细胞，单核; 基因表达谱; 信号传导； 基因芯片

　　Identification of Signal Transduction-related Genes in Peripheral Blood Mononuclear

    Cells from Intracranial Aneurysm Patients Using Gene Chip

    SHI Zhong-song, LI Ming-chang, SUN Yi-ming, ZHU Yong-hua, DAI Hua-hao,

    PAN Wei-sheng, HUANG Zheng-song

    ( Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510080 China )

    Abstract:【Objective】 To identify signal transduction-related genes in peripheral blood mononuclear cells from intracranial aneurysm patients using oligo-microarrays.【Methods】 Blood samples from 50 intracranial aneurysms and 10 healthy human donors were obtained after informed consent. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from blood using Ficoll method. The cDNA were retrotranscribed from the extracted RNA and the biotin-labeled cRNA derived from the transcription of cDNA were fragmented as probes. Then, the probes were hybridized with Affymetrix Human Genome U133A Array. Gene Array Scanner was used to screen the signals of hybridization and Microarray Suite software 5.0 was applied to analyze the expression of genes. 【Results】 There were 325 genes differently expressed in PBMCs from intracranial aneurysm patients compared to healthy human. Function analysis were confirmed from 21 upregulated genes and 14 downregulated genes above 2-fold level. Among these genes, there are 7 genes invovled in signal transduction. 【Conclusions】 The methodologies of gene chip of PBMCs will provide a new powerful approach to identify the molecular mechanisms of intracranial aneurysm. Signal transduction may be the possible mechanism for the pathogenesis of intracranial aneurysms in Chinese.

    Key words: intracranial aneurysm; leukocytes, peripheral blood mononuclear cell; gene expression profile; signal transduction; gene chip

    [J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 66-69；74]       近年基因芯片技术在人类疾病诊断、发病机制及疾病易感性研究中起到重要作用[1]，在血管性疾病如主动脉瘤的发病机制研究中也逐渐有应用基因芯片技术的报道[2]。颅内动脉瘤的发病机制目前尚不明确，我们前期对手术切除的颅内动脉瘤组织标本进行基因芯片研究，初步建立国人颅内动脉瘤组织基因表达谱[3]。本研究利用来源较充足的血液遗传信息库，进一步探讨国人颅内动脉瘤患者外周血单核细胞（PBMC）基因表达谱，发现了一些颅内动脉瘤可能致病相关基因群，其中多个基因与信号传导机制密切相关，为阐明颅内动脉瘤的发生机制和寻求早期诊断分子标记物提供了新线索，现报告如下。

 1   材料和方法

    1．1   颅内动脉瘤患者PBMC的分离

    50例患者均经数字减影脑血管造影诊断为颅内囊性动脉瘤，年龄32～63岁，男性24例，女性26例，分别采集其2 mL外周血。每10例患者随机组合为一组，另取10名体检正常的成人健康志愿者作为对照组，每组将已分离的PBMC混合后提取RNA。Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，简述如下：2 mL外周血加入EDTA抗凝剂，用半径为16 cm的水平离心机以1 500 r/min离心20 min，弃上清血浆，加入2 mL淋巴细胞分离液， 1 500 r/min 离心20 min，吸取中间层的单核细胞，1 500 r/min离心5 min，去上清后加入0.3 mL RNA Later，－80 ℃保存用以抽提RNA。

    1．2   试剂、基因芯片及主要设备

    TRIzol试剂盒、RNeasy Mini Kit（Qiagen公司，德国）、T7-(dT)24引物、dNTP（Promega公司，美国）、SuperScript Ⅱ逆转录酶（Invitrogen公司，美国）、DNAligase、DNA多聚酶Ⅰ、RNA酶H(Invitrogen公司，美国；MEGAscript T7 In Vitro transcription Kit(Ambion公司，美国)；Human Genome U133A array(Affymetrix公司，美国)；GeneChip hybridization Oven 640（Affymetrix公司，美国）、GeneChip Fluidics Station 400（Affymetrix公司，美国）、GeneArray Scanner(Affymetrix公司，美国)、Microarray Suite Version 5.0分析软件(Affymetrix公司，美国)等。

    1．3   基因芯片的方法[4,5]

    Human Genome U133A array芯片包含人类基因组中的22  215个已知或未知基因和EST片段。按TRIzol试剂盒说明从PBMC样本中抽提总RNA，RNeasy Mini Kit纯化，1％DEPC水溶解后在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度，同时凝胶电泳检测RNA有无降解。按SuperScript Ⅱ试剂盒操作说明反转录成cDNA，并以Affymetrix公司的RNA Transcipt Labeling Kit进行体外转录合成cRNA探针及生物素标记。

    合成后的cRNA探针经片段化处理后加入基因芯片内，置入杂交炉640中45 ℃杂交16 h，然后在基因芯片流程工作站400中洗脱、染色。为了确保芯片检测结果的可靠性，片段化后的cRNA探针先与一张检测芯片（test chip）进行杂交，经GeneArray Scanner扫描和数据分析，确认所用cRNA探针质量可靠后再与Human Genome U133A real chip杂交。

    1．4   基因芯片检测数据的处理

    GeneArray Scanner扫描杂交后的芯片，存为*.DAT图片文件，并经标准化存为*.CEL图片文件。Microarray Suite Version 5.0软件进行杂交结果分析，将检测报告生成*.CHP报告文件，并将基因检测结果转换成*.xls文件。动脉瘤组基因表达谱与正常对照组进行比较，生产散点图和差异表达基因的*.xls文件，最后将*.xls文件中的基因探针号登陆Affymetrix网站（www.affymetrix.com）进行批处理查询（Batch Query），得出探针相对应的基因及相关信息。

    1．5   荧光定量RT-PCR

    随机选取3个差异表达的基因，即CDKN1C、MNDA 、MAPK14，以?茁-actin作为内参照，根据Genebank序列号获取全长cDNA序列，由上海生工生物技术有限公司合成，行荧光定量RT-PCR检测上述3个基因的表达情况，验证芯片结果的准确性。引物序列如下：CDKN1C： 5′-ACG GCT CAG GAA CCA TTT TA-3′， 3′- act gaa cct gac cgt aca CTG CCA TAC ATG CCC ATC TA-5′；MAPK14：5′-TGC CGA GCC AGT CCA AAA-3′， 3’-act gaa cct gac cgt aca CCA AAT TCT CCG AGG TCT AAA-5′；MNDA：5′-TCC ACT CCC CAC TAC ATC CA-3′， 3′-act gaa cct gac cgt aca GTC AAC TTT ACA AGC AAG CAT CT-5′；探针为含act gaa cct gac cgt aca（Z序列）的Amplifluor引物特异性荧光标记探针（Intergen公司）。

采用Rotor Gene 3000型荧光定量PCR仪（Corbett公司）进行定量检测，总反应体系中，含逆转录产物cDNA 3 μL，10 ×buffer 3 μL，Hotstar Taq酶(3 U/ μL) 0.3 μL，dNTPs 3 μL，含Z序列引物3 μL，不含Z序列引物1.5 μL，Uniprimer 3 μL，DH2O 11.4 μL。反应条件：95　℃ 15 min预变性，95　℃ 20 s，54　℃ 30 s，72　℃ 30 s共55次循环。产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。梯度稀释后制作标准定量曲线，计算机Rotor Gene 6.0分析软件自动地计算出最适合的标准曲线方程式，并根据域值算出各样品Ct值与拷贝数。将各个样品中目的基因拷贝数与β-actin拷贝数比较，得到校正值。各个样品的校正值与对照组样品比较得到实验结果。

    2   结   果

    2．1   外周血RNA的浓度和纯度

    采用TRIzol试剂盒从颅内动脉瘤患者和健康志愿者PBMC样本中抽提的总RNA A260/ A280比值均在1.9～2.1之间，电泳显示28S和18S两条清晰的条带(图1)，后带荧光亮度大约是前带的2倍且无明显的拖尾现象，两者比值约为2 ∶ 1，证实提取的RNA无降解、完整性佳，可用于下一步的基因芯片检测。

    2．2   检测芯片的质量情况

    颅内动脉瘤患者外周血和健康志愿者外周血中的cRNA与检测芯片(testchip)杂交后的扫描图检测报告表明，杂交芯片的背景值(backgroud)、噪音值(Noise)均匀，管家基因对照(Housekeeping controls)中的β-actin和GAPDH的3′端和5′端的信号比值均低于3.0的标准；外加的阳性对照信号值逐渐升高。这些情况说明，基因芯片和样品RNA的质量良好，杂交反应体系正常，芯片检测的结果可靠，可依此进入U133A杂交检测流程。

    2．3   芯片检测结果分析

    Affymetrix公司寡核苷酸芯片已得到国际权威学术界的公认，在所检测的总共22 215个基因中，与正常对照组相比5组颅内动脉瘤PBMC中同时差异表达的基因有325个，约占1.46%。差异表达水平均达2倍以上的基因有35个，7个基因与信号传导有关，其中高表达的基因有FPRL1、FRAT2、KCNJ15、MAPK14和MS4A4A，明显低表达的基因有DUSP8和RANBP2L1。另外也有多个基因呈下调状态，如ARHGAP4、ARHGAP8、GPR56、MAP4K1、PRKCH、RANBP9、RAP2C、RASG RP2、STAT4、 CENTG2、DUSP5和EVL(表1)。

    2．4   荧光定量RT-PCR结果

    荧光定量RT-PCR发现动脉瘤与正常对照组PBMC中，CDKN1C、MAPK14、MNDA 3个基因原始数据平均值根据看家基因β-actin校正起始量后计算相对于样本A的相对值，CDKN1C与β-actin比值小于1，MAPK14与b-ACTIN、MNDA与β-actin比值大于1，显示3个基因的变化倍数与基因芯片检测结果不完全相同，但变化方向一致，证明基因芯片结果是准确可靠的。

    3   讨   论

    3．1   基因芯片技术在脑血管疾病研究中的应用

    近年国外学者[6]采用基因芯片技术探讨神经系统疾病血液白细胞的基因表达谱，发现在鼠缺血性中风、出血性中风和癫痫动物模型同正常鼠相比，血液白细胞中有许多差异表达的上调或下调基因，认为不同疾病情况下血液基因组表达模式有差别。表明血液基因表达谱在脑血管病的诊断、机制研究和疗效判定中可能具有潜在的应用价值。我们以往通过基因芯片技术在颅内动脉瘤组织的基因表达谱研究中发现细胞外基质、信号传导分别是重要发病机制[5]，故本研究拟从血液单核细胞RNA入手判断颅内动脉瘤的基因表达谱中是否存在与信号传导相关基因群的明显差异表达。

3．2   G蛋白信号传导通路和颅内动脉瘤的关系

    G蛋白信号传导通路是一条重要的信号传导通路，主要通过改变细胞内第二信使的浓度来影响血管平滑肌细胞生物学行为。G蛋白对维持血管壁的完整性以及调节血管张力起着极为重要的作用。研究表明G蛋白含量异常及功能紊乱,可能与高血压、动脉粥样硬化、冠心病和经皮冠脉腔内血管成形术后再狭窄等有极为重要的关系[7]。类甲基肽受体1（FPRL1）是一种G蛋白耦联受体，有研究表明其在炎性关节炎的滑膜组织中高表达[8]。FPRL1参与单核巨噬细胞的聚集和激活，与Alzheimer′s病也存在一定关系[9]。本研究发现FPRL1在颅内动脉瘤血液PBMC中明显高表达，而另一个G蛋白耦联受体－GPR56在颅内动脉瘤血液PBMC中低表达。Ras蛋白、Rab蛋白和Rho蛋白均作为小分子G蛋白参与细胞信号传导，ARHGAP4、ARHGAP8为Rho蛋白，RANBP2L1、RANBP9、RAP2C和RASGRP2为Ras蛋白，它们在颅内动脉瘤血液PBMC均低表达。多种与G蛋白信号传导通路相关的基因在颅内动脉瘤血液PBMC中差异表达，提示G蛋白信号传导通路可能是颅内动脉瘤的一种重要发病机制。

    3．3   MAPK信号通路和颅内动脉瘤的关系

    MAPK介导的信号转导途径是细胞内多种细胞增殖信息传递的共同通路， 可能是生长因子、细胞因子促增殖的一条主要途径。MAPK主要由3个成员组成， 即细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、应激活化蛋白激酶(JNK)和蛋白激酶p38。JNK和p38MAPK主要介导应激反应，而ERKs主要介导生长因子和细胞因子所引起的细胞增殖反应，其中ERK1和ERK2是最重要的MAPK家族成员，是MAPK传导通路中的重要枢纽，是细胞因子、生长因子介导细胞增殖效应中最重要的途径。本研究发现在颅内动脉瘤血液PBMC中MAPK14明显高表达。而Absi等[10]的主动脉瘤基因表达谱研究发现MAPK9在胸主动脉瘤和腹主动脉瘤中均高表达，故我们预测MAPK信号通路可能与颅内动脉瘤有一定关系。

    DUSP8和DUSP5是双重特异性磷酸酶（dual specificity phosphatase，DUSP）超家族的两个成员。DUSP 对MAPK家族的成员(MAPK/ERK、MAPK/JNK和p38)进行负性调节作用，该家族的不同成员对MAPK家族的不同成员表现各自的底物特异性。DUSP8对MAPK/JNK和p38起灭活作用，而DUSP5灭活ERK1的活性[11]。本研究发现在颅内动脉瘤血液PBMC中DUSP8明显低表达，且DUSP5也呈低表达，表明DUSP家族可能与颅内动脉瘤的形成有一定关系。

    此外颅内动脉瘤血液PBMC中参与Wnt信号通路的FRAT2、钾离子通道膜蛋白KCNJ15、蛋白激酶C成员PRKCH、信号传导与转录激活因子STAT4，存在不同程度的差异表达。

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