老年与青壮年脑挫裂伤组织NGF的表达差异及意义

　　作者：高进喜,庄志军,王如密,王守森,郑兆聪　　作者单位：中国人民解放军南京军区福州总医院神经外科， 福建 福州 350025

　　【摘要】目的 研究衰老对脑挫裂伤组织神经生长因子 (NGF) 基因表达的影响，进一步探讨老年颅脑损伤病人神经功能缺失程度较重的分子生物学机制。 方法 收集重型颅脑损伤开颅手术中的脑挫裂伤组织，应用免疫组化和医学数码图像分析技术，观察老年组 (≥60岁) 和青壮年组 (19～59岁) 病人脑损伤后3～9 h 脑挫裂伤组织NGF蛋白的表达差异。 结果 脑损伤后NGF在老年和青壮年脑挫裂伤组织中的表达均明显增强;老年组脑挫裂伤组织中的NGF蛋白表达显著性低于青壮年组 (P <0.05)。 结论 老年人脑挫裂伤后NGF表达水平下降明显，提示其受损神经元的修复和生存能力降低，这可能是老年颅脑损伤病人恢复不良的重要原因之一。

　　【关键词】 颅脑损伤 老年人 神经生长因子 免疫组织化学

　　Expression difference and its significance of NGF in the contusive

　　or lacerated brain tissue in the aged and young patients

　　GAO Jinxi, ZHUANG Zhijun, WANG Rumi, et al

　　Department of Neurosurgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command, Fuzhou 350025, China

　　Abstract: Objective To study the effect of aging on the expression of nerve growth factor (NGF) protein in the contusive or lacerated brain tissue after traumatic brain injury (TBI), and furthering explore the molecular biological mechanism for old patients having more severe neurological deficits. Methods The contusive and lacerated brain tissues 3 to 9 hours after TBI were collected, and the expressions of NGF protein of the aged group (≥ 60 years old) and young group (19 to 59 years old) were analyzed by immunohistochemistry and digital image analysis system, to determine the possible susceptibility differences in the expression of NGF protein between the two groups. Results In the contusive and lacerated brain tissue, the expression of NGF protein was increased after TBI. However, the level of NGF protein in the contusive and lacerated brain tissue was statistically lower in the aged group than in the young group (P<0.05). Conclusion The expression of NGF after TBI is influenced by age. The lower level expression of NGF in aged patients suggests that the recovery and survival ability of aged neurons is lowered, which might be an important reason for the bad recovery of the aged patients after craniocerebral injury.

　　Key words: craniocerebral trauma; aged; nerve growth factor; immunohistochemistry 我们在先前的研究中发现：液压打击脑损伤后，老龄大鼠脑组织中神经生长因子 (NGF) 表达显著性低于幼龄大鼠，并推测这可能是衰老动物颅脑损伤预后不良的重要原因[1]。为了进一步探讨老年颅脑损伤预后不良的病理生理机制，本研究观察了老年与青壮年病人脑挫裂伤脑组织中的NGF蛋白表达差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 脑挫裂伤组织标本 2004年7月~2005年2月，南京军区福州总医院与空军476医院 (福州总医院476临床部) 对58例颅脑损伤病人急诊行颅内血肿清除术和 (或) 去骨瓣减压术，术中去除容易吸除的坏死中心后，用取瘤钳从缺血半暗带 (periischemic zone，PIZ) 区咬除2～3个体积为6 mm3的样本;样本选取部位由外科医师记录，并尽可能靠近术前CT所示挫裂伤部位。标本采集前均取得病人家属同意。

　　1.2 病例选择条件 ①病情选择：均为重型颅脑损伤，GCS 6~8分。②时间窗选择：伤后3~9 h手术。③标本来源部位：额颞叶皮质脑挫裂伤组织。④临床及随访资料完整。⑤资料证明入院前和手术时没有低血压、血容量减少、缺氧，并排除原来患有严重神经系统、心血管系统、呼吸系统、泌尿系统等疾病。⑥为了保持样本组织学的一致性，复染后发现坏死区域和 (或) 炎性细胞浸润太接近坏死中心与PIZ区交点者，予以排除。⑦年龄>18岁。符合进一步实验的标本有36例。

　　1.3 分组 年龄≥60岁为老年组，共11例;其中男7例，女4例;平均年龄 (70.2 ± 5.0) 岁。19~59岁为青壮年组，共25例;其中男17例，女8例;平均年龄 (36.1 ± 10.6) 岁。

　　1.4 正常对照组脑组织标本收集 选取福州总医院颞叶癫和 (或) 颞叶血管畸形手术病人11例，收集颞叶皮质同样体积的脑组织，作为对照。分组：老年对照组4例，其中男3例，女1例;平均年龄 (67.2 ± 5.8) 岁。青壮年组7例，其中男4例，女3例;平均年龄 (32.4 ± 12.6) 岁。标本采集前均取得病人家属同意。

　　1.5 NGF免疫组化染色 取液氮保存的脑组织冰冻切片，间隔5 μm冠状切片，先行苏木精-伊红染色观察，再行NGF免疫组化染色 (采用Elivision法)。兔抗人NGF多克隆抗体来自Santa Cruz 生物科技公司。

　　1.6 免疫组化分析 应用Motic med 6.0数码医学图像分析系统，输入方式为普通光源照明，每张切片在低、中、高倍镜下 (10 × 10、10 × 20、10 × 40) 观察，每个病人分别观察4张切片，每张切片分别随机采集5个高倍视野，输入医学图像分析系统，计算挫裂伤组织NGF蛋白阳性细胞平均数/mm2。

　　1.7 统计学分析 数据用均数 ± 标准差 (x ± s) 表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，P <0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 阳性细胞分布 NGF免疫阳性细胞呈棕红色，由于NGF蛋白主要分布于细胞质，细胞核内量少，因此阳性细胞的胞质染色较深而胞核色淡。挫裂伤组NGF阳性细胞主要分布于受损大脑皮质 (图1)。

　　2.2 阳性细胞计数 正常对照组NGF免疫组化染色均为阴性或弱阳性，老年对照组与青壮年对照组差异无统计学意义。脑挫裂伤组NGF免疫组化染色均为阳性，并且为明显的高表达，老年组和青壮年组分别为 (407.3 ± 28.6)/mm2和 (479.0 ± 60.0)/mm2。统计结果显示：老年组与青壮年组之间差异具有统计学意义 (P <0.05)。

　　3 讨 论

　　NGF是典型的神经营养因子，能促进中枢及外周神经元的分化、生长及存活，在个体发育、成熟和衰老过程中，脑内NGF含量有着复杂的变化。NGF于出生后明显增加，可在2周内上升5~6倍，此后又下降至一个稳定的水平;到老年期，NGF含量又显著下降。这种复杂变化可能与神经细胞的分化、功能联系的建立与维持及衰老等有密切关系。多种研究表明：颅脑损伤后，NGF的表达增高是一种内源性保护机制，它对受损神经细胞的分化、功能维持和生存起着十分重要的作用[2，3]。特别是颅脑损伤早期，大量受损的神经元均在竞争十分有限的NGF，如果不能得到充足的NGF支持来完成自身修复和功能维持，就可能发生迟发性神经元死亡 (DND)。还有研究表明：NGF通过凋亡机制影响受损神经元的转归。因此，我们选择颅脑损伤后的NGF表达水平作为评价神经元修复和生存能力的重要指标。此外，由于NGF基因属于即刻早期基因，NGF的早期表达与颅脑损伤的预后关系密切，因此，本实验选取较为关键的损伤早期 (3~9 h) 作为观察时间点。

　　本实验结果表明：正常对照组NGF蛋白表达为阴性或弱阳性，老年对照组与青壮年对照组差异无统计学意义;而颅脑损伤后，老年组病人脑挫裂伤组织NGF表达显著性低于青壮年组。颅脑损伤病人脑挫裂伤组织NGF蛋白免疫阳性细胞大量增加，这与其他有关神经损伤后NGF表达变化的报道是一致的[4，5]。老年病人NGF蛋白表达下降，表明衰老神经元受损后修复能力减退，这与我们前期的动物实验结果[1，6]一致。这些发现为进一步阐明老年颅脑损伤病人预后不良的病理生理学机制提供了帮助。

　　许多研究表明：在缺血、缺氧、癫和外伤后，NGF表达增加可能是中枢神经系统用以维持神经元功能和存活的内源性保护机制，如能通过药物干预手段在中枢神经损伤后的关键时段使NGF表达增强，即可能减轻神经损伤程度，起到治疗神经损伤的作用，但其临床应用仍有许多问题有待解决。目前认为最理想的治疗是基因治疗，将对神经再生有利的基因定位植入脑内特定部位，使其长时间持续合成、释放NGF，并在损伤部位达到一定水平，保护受损神经元及促进其再生，从而达到治疗目的。对动物模型已进行了基因治疗的尝试，并取得了较好效果，Watson等[7]及Longhi等[8]实验证明：可表达NGF的基因修饰Ntera-2 (NT-2) 细胞移植能显著减弱颅脑损伤后的认知功能障碍。这些研究为颅脑损伤的临床治疗开辟了可喜的前景。另有研究发现：β2受体激动剂——克仑特罗能选择性增加老龄大鼠颅脑损伤后内源性NGF的合成[9]。有关的进一步研究可能对改善老年颅脑损伤病人预后带来帮助。

　　【参考文献】

　　[1] 高进喜, 卢亦成, 江基尧, 等. 幼龄和老龄大鼠液压脑损伤后NGF、Bcl-2、Bax蛋白的表达 [J]. 第二军医大学学报, 2003, 24(5): 496-498.

　　[2] SEMKOVA I, KRIEGLSTEIN J. Neuroprotection mediated via neurotrophic factors and induction of neurotrophic factors [J]. Brain Res Brain Res Rev, 1999, 30(2): 176-188.

　　[3] PUTCHA G V, LE S, FRANK S, et al. JNK-mediated BIM phosphorylation potentiates BAX-dependent apoptosis [J]. Neuron, 2003, 38(6): 899-914.

　　[4] JARSKOG L F, GILMORE J H. Developmental expression of Bcl-2 protein in human cortex [J]. Brain Res Dev Brain Res, 2000, 119(2): 225-230.

　　[5] HAMNER S, SKOGLOSA Y, LINDHOLM D. Differential expression of bcl-w and bcl-x messenger RNA in the developing and adult rat nervous system [J]. Neuroscience, 1999, 91(2): 673-684.

　　[6] 高进喜, 卢亦成, 王如密, 等. 幼龄和老龄大鼠液压颅脑伤后NGF mRNA表达差异 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2004, 3(5): 424-427.

　　[7] WATSON D J, LONGHI L, LEE E B, et al. Genetically modified NT2N human neuronal cells mediate long-term gene expression as CNS grafts in vivo and improve functional cognitive outcome following experimental traumatic brain injury [J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2003, 62(4): 368-380.

　　[8] LONGHI L, WATSON D J, SAATMAN K E, et al. Ex vivo gene therapy using targeted engraftment of NGF-expressing human NT2N neurons attenuates cognitive deficits following traumatic brain injury in mice [J]. J Neurotrauma, 2004, 21(12): 1723-1736.

　　[9] 高进喜, 卢亦成, 江基尧. 克仑特罗对幼龄和老龄大鼠液压脑损伤后神经生长因子、bcl-2和bax蛋白表达的调节作用 [J]. 中华实验外科杂志, 2003, 20(8): 764.