罗格列酮抑制垂体腺瘤GH3细胞及促凋亡作用的研究

　　作者：董齐,胡志强,伊然3,孔宪刚　　作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院 1. 神经外科; 3. 内分泌科， 黑龙江 哈尔滨 150001; 2. 北京世纪坛医院神经外科， 北京 100038; 4. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所， 黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】目的探讨罗格列酮对GH3细胞增殖的影响及其促细胞凋亡的机制。 方法 不同浓度罗格列酮作用GH3细胞后，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，Elisa法分析罗格列酮对生长激素合成的影响，Western blot法分析GH3细胞Cyclin D3、bcl-2和bax的变化。 结果 罗格列酮作用GH3细胞48 h后，以浓度效应关系抑制GH3细胞增殖、并使细胞增殖周期中G0-G1期阻滞，S期和G2-M期百分率降低; Western blot法示罗格列酮作用GH3细胞提高了Cyclin D3和bax的表达，而bcl-2的表达降低。 结论 罗格列酮促GH3细胞凋亡并抑制GH分泌，可能成为垂体生长激素腺瘤病人新的治疗方法。

　　【关键词】 垂体肿瘤 生长激素 噻唑烷二酮类

　　Rosiglitazone induces growth inhibition and apoptosis of pituitary GH3 cells

　　DONG Qi1, HU Zhiqiang2, YI Ran3, et al

　　1. Department of Neurosurgery, 3. Department of Endocrinology, First Hospital Affiliated to Harbin Medical University, Harbin 150001, China; 2. Department of Neurosurgery, Shijitan Hospital, Beijing 100038, China

　　Abstract: Objective To explore the effects of rosiglitazone on rat GH-secreting (GH3) cell proliferation and its role in apoptosis. Methods After different concentrations of rosiglitazone acted on GH3 cells, the cell cycle and apoptosis were assessed by FACS analysis. The effects of rosiglitazone on GH synthesis were evaluated by ELISA. Expressions of cyclin D3, bcl-2 and bax were evaluated by Western blotting. Results After treatment of CH3 cells with rosiglitazone for 48 h, the cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner. G0-G1 cell cycle phase was blocked and cell proportion in the S and G2-M phase decreased significantly. Rosiglitazone increased the expression of cyclin D3 and bax, decreased the expression of bcl-2. Conclusion Rosiglitazone suppress GH secretion as well as apoptosis and has the potential of being used to treat pituitary growth hormone-secreting adenomas

　　Key words: pituitary neoplasms; growth hormone; thiazolidinediones　　 近年研究发现：噻唑烷二酮类药物 (TZDs，包括曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮) 可以抑制肿瘤细胞生长[1]，具有抗垂体腺瘤作用[2]。本实验通过观察罗格列酮对GH3细胞系的影响，研究TZDs抗垂体腺瘤的作用并对其机制进行探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 GH3细胞培养 GH3大鼠垂体腺瘤细胞株 (引自中国医学科学院基础所细胞中心)，Ham's F10培养基加入热灭活15%马血清和2.5%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，160 U/L胰岛素，5 U/L青霉素，5 μg/ml链霉素。细胞常规在37 ℃、5% CO2、100%湿度的孵箱中培养。培养基视GH3细胞生长情况3～4 d更换1次，7～8 d传代1次。实验前在显微镜下观察并取形态良好、呈对数生长期的GH3细胞更换为无血清无酚红的Ham's F12培养基培养，加入10 μmol/L胰岛素，5 μg/ml转铁蛋白，0.5 ng/ml甲状旁腺素，GH3细胞每天换液1次，待细胞贴壁24 h后给予药物进行实验。

　　1.2 细胞增殖检测 GH3细胞在96孔板培养至第3天换无血清F12培养液，24h后换含不同浓度的罗格列酮 (1～100 μmol/L)，对照组为无血清F12培养液。孵育4 h，中止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜 (DMSO) 150 μl，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度 (A490nm值)，重复3次，计算变化率。变化率 (%) = (试验组A490nm值/对照组A490nm值) × 100%。

　　1.3 细胞周期测定 GH3细胞在24孔板培养至第3天换无血清F12培养液，24 h后换含不同浓度的罗格列酮 (1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)，对照为无血清F12培养液。孵育48 h，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，离心，收集细胞，PBS洗2次，1 000 rpm离心5 min，弃上清，加入碘化丙啶 (PI) 染色，混匀后于室温避光孵育20 min，加PBS 1 ml轻轻吹匀细胞，用流式细胞仪 (FACS) 测定细胞周期，随机软件分析测量值。

　　1.4 细胞凋亡检测 上述方法作用、收集GH3细胞，用4 ℃预冷的PBS洗细胞2次，用250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1 × 106/ml，取100 μl细胞悬浮于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 20 μg/ml PI溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400 μl PBS，FACS分析。

　　1.5 ELISA检测GH3细胞培养液中生长激素 (GH) 浓度

　　1.5.1 基础分泌： GH3细胞24孔板培养48 h后换无血清F12培养液，24 h后换含不同浓度的罗格列酮 (1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)，对照组为无血清F12培养液;孵育48 h，收集上清，置于-20 ℃保存。

　　1.5.2 分泌时间： GH3细胞24孔板培养48 h后换无血清F12培养液，24 h后换含50 μmol/L罗格列酮的无血清F12培养液，对照组为无血清F12培养液，分别于加药后12 h、24 h、48 h收集上清，-20 ℃保存。

　　1.5.3 GH检测： 用大鼠GH ELISA试剂盒检测收集上清中的GH浓度。检测时首先加100 μl标准品和标本于相应反应板孔中，轻混匀30 s，封住板孔4 ℃过夜;甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板5次，每孔内加入300 μl洗涤液，拍干板内液体，每孔加入100 μl 1 × Biotin，轻混匀30 s，封住板孔，37 ℃温育2 h;甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板5次，拍干板内液体，每孔加入100 μl 1 × HRP，轻混匀30 s，封住板孔，37 ℃温育2 h;甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板5次，拍干板内液体，每孔加入100 μl TMB显色液，轻混匀10 s后于37 ℃暗处温育20 min;最后每孔加入100 μl终止液，轻混匀30 s，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度 (A450nm值)，计算变化率。变化率 (%) = (试验组A450nm值/对照组A450nm值) × 100%。

　　1.6 Western印迹法 GH3细胞培养液中加入50 μl罗格列酮作用72 h后，加入-4 ℃ RIPA裂解液裂解细胞，12 000 rpm，4 ℃离心15 min去除细胞碎片后，留取上清液，取少量上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。取含30～75 μg蛋白的细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳，蛋白转移到PVDF膜上，2%牛血清白蛋白室温封闭过夜，TBS-T洗涤液洗膜4次，每次5 min，分别加入一抗 (Cyclin D3、bcl-2、bax)，以β肌动蛋白作为内参，于4 ℃条件下孵育过夜，再加入二抗 (辣根过氧化物酶结合的抗体)，室温下摇动1 h，洗膜，用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。用quantity one软件测量条带的灰度，再以β肌动蛋白的灰度值为基础，测定各组的相对比值，同时设对照组的相对比值为1。每组试验重复5次，取平均值。

　　1.7 统计学处理 实验数据以均数 ± 标准差表示，运用SPSS12.0统计软件分析。

　　2 结 果

　　2.1 罗格列酮对GH3细胞增殖的影响 1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L罗格列酮均可抑制GH3细胞增殖，细胞生长抑制率分别为31.7%、45.6%、51.1%和58.7%并呈剂量-效应关系;不同浓度罗格列酮作用GH3细胞48 h后细胞生长抑制率达到高峰，随作用时间延长，细胞生长抑制率趋于缓和 (P >0.05)。

　　2.2 罗格列酮对GH3细胞周期分布的影响 GH3细胞在无血清无酚红的条件下培养3 d，随培养时间延长，S期细胞比例升高，36 h达最高。与对照组比较，50 μmol/L罗格列酮作用于GH3细胞时，在各时间点均发生G0-G1期阻滞，G0-G1期细胞比例升高，S期和G2-M期细胞比例下降 (表1)。在各相同时间点，实验组与对照组间的G0-G1期和S期细胞百分比差值在36 h达到最高，G0-G1期、S期差值分别为6.6%和5.9%;两组细胞G0-G1期、S期的变化差异有统计学意义 ( P <0.05)，表明GH3细胞由G0-G1期向S期的转化受到抑制。

　　2.3 罗格列酮对GH3细胞凋亡的影响 GH3细胞在无血清无酚红的条件下培养48 h，在各时间点行Annexin V-FITC/PI染色后FACS分析，只有少量GH3细胞发生凋亡，细胞凋亡率呈时间依赖性。与对照组比较，50 μmol/L罗格列酮可增加凋亡细胞的比率 (图1)，且随时间延长，细胞凋亡率增加，48 h时凋亡率达16.9% (表2)。

　　2.4 罗格列酮对GH3细胞GH分泌的影响

　　2.4.1 罗格列酮抑制GH3细胞GH的基础分泌： 以对照组的GH浓度值为100，不同浓度的罗格列酮 (1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L) 对GH3细胞的GH基础分泌均有抑制作用，且存在剂量效应，其变化率分别为 (97.36 ± 1.8) %、(93.35 ± 3.6) %和 (89.72 ± 4.08) % (P <0.05)。

　　2.4.2 罗格列酮抑制GH3细胞GH分泌的时间曲线： 50 μmol/L罗格列酮分别作用12 h、24 h、48 h后，均可抑制GH3细胞GH分泌，其变化率分别为 (96.5 ± 1.6) %、(92.1 ± 2.7) %和 (89.7 ± 2.9) % (P <0.05)。

　　2.5 罗格列酮对Cyclin D3表达的影响 在无血清无酚红的培养条件下，对照组和实验组GH3细胞均可见Cyclin D3蛋白的表达，实验组表达量明显低于对照组。随时间延长，表达逐渐增强，对照组在36 h达到最高，实验组在48 h达到最高，药物组始终弱于对照组 (图2)。实验组和对照组各时间点条带灰度值的半定量蛋白表达量的差异有统计学意义 (P <0.05)，提示实验组细胞在罗格列酮的作用下，与对照组比较，Cyclin D3表达峰值时间延迟，表达量下调。

　　2.6 罗格列酮对bcl-2和bax表达的影响 (图3，4) 无血清无酚红的培养条件下，分别作用24 h、48 h后，与对照组比较，50 μmol/L罗格列酮可使GH3细胞中抑制凋亡基因bcl-2表达减少，而促进凋亡基因bax表达增加，且此种效应呈时间依赖性。

　　3 讨 论

　　垂体腺瘤细胞增殖活性与垂体腺瘤的临床特征有密切关系，而细胞周期阻滞和凋亡是抗肿瘤药物发挥作用的主要机制。过氧化物酶体增殖物激活受体γ的人工合成配体罗格列酮作为抗糖尿病药物在最新的研究中证明：其可抑制肿瘤细胞增长，具有抗垂体腺瘤作用。

　　细胞周期蛋白D (Cyclin D) 是表达于G0-G1期的细胞周期蛋白，Cyclin D分为D1、D2、D3三个亚型，分别由位于11q13的CCND1、12q13的CCDN2和6q21的CCDN3基因编码，其在细胞中的表达是特异的。目前研究发现：肿瘤发生与Cyclin D关系很密切，Cyclin D表达下降可导致细胞周期阻滞。免疫组化证实，GH3细胞主要表达Cyclin D3，同时表达极少量Cyclin D1，且实验证实携带Cyclin D基因的质粒转染GH3细胞后，可促进GH3细胞生长[3，4]。本实验在12 h、24 h时Cyclin D3表达变化不明显，但随时间延长，对照组和实验组细胞Cyclin D3表达均增强， 36 h时对照组Cyclin D3表达最高，实验组在48 h时Cyclin D3达到最高，但实验组表达量始终低于对照组。罗格列酮抑制GH3细胞Cyclin D3表达，并使Cyclin D3表达峰值延迟，细胞周期时相发生改变，阻滞了细胞从G0-G1期向S期转化的进程，说明罗格列酮通过抑制Cyclin D3表达影响GH3细胞周期。

　　凋亡是指细胞的程序性死亡，是由基因控制的自主性的有序死亡过程。凋亡机制非常复杂，是多基因、多阶段的过程，可能机制包括作用于细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶而致凋亡;通过p53触发凋亡;影响bcl-2家族诱导凋亡;通过线粒体介导凋亡;通过死亡因子及其受体介导凋亡等。本研究对照组GH3细胞在无血清无酚红的培养条件下，GH3细胞发生凋亡，细胞凋亡率呈时间依赖性。与对照组比较，罗格列酮可使凋亡细胞的比率增加，在罗格列酮作用24 h、48 h后，GH3细胞凋亡率随时间延长而明显增加，48 h时凋亡比率达16.9%。进一步证实细胞凋亡是罗格列酮杀伤GH3细胞的作用机制之一。本实验GH3细胞在无血清无酚红的培养条件下即发生凋亡， 因此无血清的培养条件可诱导GH3细胞发生凋亡，而罗格列酮可能增强了去血清所诱导的凋亡，但也不能排除罗格列酮直接诱发GH3细胞发生凋亡的可能性。因此，进一步探讨罗格列酮诱导GH3细胞凋亡的分子机制具有重要意义。

　　bcl-2是特异的抑制细胞凋亡的基因，在细胞凋亡的调控过程中起重要作用，它可通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，导致细胞数目增加。在某些肿瘤细胞中，bcl-2基因表达上调，使肿瘤细胞逃逸死亡或寿命延长，表明bcl-2基因与肿瘤的发生密切相关。bcl-2倾向于分布在生长细胞和增殖细胞。bax基因则是凋亡促进基因，与bcl-2 基因同属一族，不但可拮抗bcl-2的凋亡抑制作用，而且还可直接促进细胞凋亡。bax基因倾向于分布在终末分化细胞和退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强。bax基因编码区含有与bcl-2 基因高度同源的BH1和BH2结构域，该区是其形成二聚体参与细胞凋亡调节的主要结构基础，对于bcl-2来说，BH1和BH2结构域是主要的功能区域。现有研究已证实：bax表达的增加和 (或) bcl-2表达的抑制均可导致线粒体膜渗透性转换，引起线粒体细胞色素C的释放，转而诱发Caspase-3的激活导致凋亡[5]。Diaz等[6]提出bcl-2与bax的比值决定了细胞接受刺激后是否凋亡。Sambaziotis等[7]认为bcl-2/bax比值更有意义。本研究结果表明：罗格列酮可使GH3细胞bcl-2的蛋白表达水平下调，而上调bax蛋白表达水平，从而使bcl-2/bax比值下降，且随时间延长，罗格列酮的此种效应逐渐增强。这可能是罗格列酮诱导GH3细胞凋亡的分子机制之一，即通过介导bcl-2的表达下调和bax的表达上调而实现。

　　综上所述，罗格列酮可诱发GH3细胞发生G0-G1期阻滞，诱发和增强GH3细胞凋亡，同时可降低Cyclin D3的表达，也影响与凋亡密切相关的bcl-2、bax蛋白的表达;提示过氧化物酶体增殖物激活受体γ的人工合成配体罗格列酮可能成为对生长抑素类似物不敏感的垂体GH腺瘤新的理想治疗药物。

　　【参考文献】

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　　[2] HEANEY A P, FERNANDO M, MELMED S. PPAR-gamma receptor ligands: novel therapy for pituitary adenomas [J]. J Clin Invest, 2003, 111(9): 1381-1388.

　　[3] JORDAN S, LIDHAR K, KORBONITS M, et al. Cyclin D and cyclin E expression in normal and adenomatous pituitary [J]. Eur J Endocrinol, 2000, 143(1): 1-6.

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　　[5] ITO T, AKAO Y, YI H, et al. Antitumor effect of resveratrol oligomers against human cancer cell lines and the molecular mechanism of apoptosis induced by vaticanol C [J]. Carcinogenesis, 2003, 24(9): 1489-1497.

　　[6] DIAZ J L, OLTERSDORF T, HORNE W, et al. A common binding site mediates heterodimerization and homodimerization of Bcl-2 family members [J]. J Biol Chem, 1997, 272(17): 11350-11355.

　　[7] SAMBAZIOTIS D, KAPRANOS N, KONTOGEORGOS G. Correlation of bcl-2 and bax with apoptosis in human pituitary adenomas [J]. Pituitary, 2003, 6(3): 127-133.