CENP-F过度表达与脑膜瘤生成及增殖活性的相关性

　　作者：胡再虎*万经海,王晓健,李长元,肖瑾　　作者单位：1. 安徽医科大学第一附属医院神经外科， 安徽 合肥 230022; 2. 中国医学科学院协和医科大学肿瘤医院 神经外科，北京 100021

　　【摘要】 目的 探讨着丝粒/动粒复合体蛋白F (CENP-F) 表达与脑膜瘤的生成及增殖活性之间的关系。 方法 采用免疫组化方法检测65例脑膜瘤和10例正常脑组织石蜡标本的CENP-F表达，并采用逆转录聚合链反应 (RT-PCR) 方法检测11例新鲜脑膜瘤和10例新鲜正常脑组织标本中的CENP-F。 结果 CENP-F在脑膜瘤中表达明显高于正常脑组织，随着肿瘤病理分级的增加，CENP-F表达的阳性率和表达水平也增高 (P <0.05)。 结论 人类CENP-F的过度表达与脑膜瘤的生成及增殖活性之间存在着一定的关系。

　　【关键词】 脑膜瘤;着丝粒/动粒复合体蛋白F;免疫组织化学;逆转录聚合酶链反应

　　Correlation of overexpression of CENP-F to genesis and proliferation activity of meningiomas

　　HU Zaihu, WAN Jinghai, WANG Xiaojian, et al

　　1. Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China; 2. Department of Neurosurgery, Tumor Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100021, China

　　Abstract: Objective To explore correlation of the expression of CENP-F with genesis and proliferation activity of meningiomas. Methods The expression of CENP-F was detected by immunohistochemistry in 65 paraffin-embedded tumor tissues from patients with meningiomas and 10 normal brain tissues from patients with brain injuries, and 11 fresh meningioma tissues and 10 fresh normal brain tissues were detected for CENP-F by RT-PCR. Results The expression of CENP-F in meningiomas was significantly higher than that in the normal brain tissues, and positivity rate and level of the expression were raised with increase of pathological grade of tumor (P<0.05). Conclusion The overexpression of human CENP-F is possibly associated with genesis and proliferation activity of meningiomas.

　　Key words: meningioma; centromere/kinetochore complex protein-F; immunohistochemistry; reverse transeriptase pdymerase chain reaction 着丝粒/动粒复合体蛋白F (CENP-F) 又叫核分裂激素，是一种调节细胞分裂的核基质蛋白，参与着丝粒蛋白外层的装配，直接构成纺缍体微管的附着点，在染色体运动和分离等方面起重要作用。脑膜瘤是中枢系统的常见肿瘤之一，本研究通过检测脑膜瘤中CENP-F的表达，探讨CENP-F过度表达与脑膜瘤生成及增殖活性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 收集2001年5月～2005年12月65例脑膜瘤石蜡标本，用于免疫组化检测;其中男20例，女45例;年龄17～78岁，平均 (47.2 ± 11.7) 岁;按2000年 WHO关于神经系统肿瘤的病理分级标准：Ι级54例，Ⅱ级5例，Ⅲ级6例。同时收集2006年1月～2006年5月，11例经病理证实的新鲜脑膜瘤标本，用于逆转录聚合链反应 (RT-PCR) 检测;其中男2例，女9例;年龄39～64岁，平均 (55.2 ± 6.9) 岁;均为WHO Ι级。另取10例正常脑组织 (颅脑外伤行手术减压) 作为对照。

　　1.2 标本处理 脑膜瘤石蜡标本连续切片6张，片厚4 μm，其中1张行苏木精-伊红染色以核实诊断，另5张用于免疫组化染色。新鲜脑膜瘤标本取后立即置于液氮中，并转移至-80 ℃低温冰箱保存。正常脑组织标本一部分用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，并制成切片;另一部分处理方法与新鲜脑膜瘤标本相同。

　　1.3 RT-PCR检测CENP-F 取100 mg冷冻标本Trizol试剂 (sangon) 用于组织匀浆，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，应用吸光度法检测RNA的质量，D260/OD280在1.8～2.0即符合要求，并计算总RNA 的含量。取总RNA 1 μg于20 μl逆转录反应体系中合成cDNA第1链，逆转录试剂盒购于Promega公司。PCR扩增应用50 μl的反应体系，包括TagDNA聚合酶0.5 μl，cDNA模板10 μl (稀释5倍) 和上下游引物各2.5 μl等。引物购于上海生工生物工程技术服务公司，上下游序列：CENP-F上游：TGTCTGCCTTGAAGAAGAAC，下游：TTAACAGCTCACTCACATCA;β-actin上游：GTGGGGCGCCCCAGGCACCA，下游：CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC。PCR的反应条件：95 ℃预变性105 s;3步循环94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环;72 ℃延伸1 min。然后取CENP-F 基因和β-actin各10 μl加入2%琼脂糖中电泳 (条件为85 kV 60 min)，应用凝胶成像仪成像系统，并求得每个CENP-F 基因与β-actin光度值之比，进行半定量分析。扩增后CENP-F 基因大小为245 bp，实验以β-actin (539 bp) 为阳性对照，PCR缓冲液为阴性对照。

　　1.4 免疫组化检测CENP-F 鼠抗人单克隆抗体 (14C10/1D8) 购于美国abcam公司，SP和DAB试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，操作严格按照SP法说明进行。一抗稀释浓度为1∶200，以已知的阳性淋巴结生发中心作为阳性对照，PBS液作为阴性对照。CENP-F表达染色为棕黄色，位于细胞核基质中。染色结果参照Iizasa等[1]方法进行半定量分析：①染色强度：阴性为0，淡染为1，中度染色为2，深染为3;②阳性细胞数比例：阴性为0，<25%为1，26%~50%为2，>50%为3。以上两者相加，积分≤1为 (-)，2为 (+)，≥3~4为 (++)，>4为 (+++)。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS12.0进行统计学分析。对RT-PCR的检测结果进行t检验，免疫组化数据应用秩和检验和Spearman相关分析，以P <0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 RT-PCR检测结果 9例脑膜瘤和4例正常组织表达CENP-F (图1)。脑膜瘤CENP-F/β-actin值为 (0.741 ± 0.029)，正常脑组织CENP-F/β-actin值为 (0.213 ± 0.014)，两者差异有统计学意义 (P = 0.001)。

　　2.2 免疫组化检测结果 CENP-F在小部分正常脑组织和大部分脑膜瘤中表达 (图2)，且其趋势与RT-PCR结果基本相同。在脑膜瘤不同分级中，CENP-F的表达水平不一，CENP-F表达水平与肿瘤分级呈正相关 (r = 0.259，P = 0.037)(表1)。

　　3 讨 论

　　基因遗传的不稳定性是肿瘤生成的重要因素，染色体数目或非整倍性的改变，是基因遗传不稳定性的一种通常表现形式，它是有丝分裂M期染色体错误分离的结果。非整倍性和肿瘤之间的这种强烈关系说明在有丝分裂进行中因为细胞正常调节功能的改变而促进了肿瘤生成[2]。因此，染色体的精确分离是基因稳定遗传的关键，在有丝分裂期，纺缍体和着丝粒在这一过程中起重要作用。

　　CENP-F是一种核基质蛋白，最初由一种人体自身免疫血清得到确认。CENP-F的cDNA编码的蛋白质有3 113个氨基酸，分子量为367 u，基因定位于人类lq32-41。有丝分裂的G1-S期，CENP-F在核基质中逐渐聚集，G2-M期达到顶峰，有丝分裂完成后迅速降解，呈细胞周期性。在有丝分裂前中期至早后期，CENP-F位于着丝粒的着丝点上，介导纺缍体微管与着丝点黏贴，同时与其他着丝点蛋白 (CENP-E) 以及调节纺缍体检查点的蛋白激酶 (Bub1) 相互作用，促进着丝粒或着丝点的成熟、染色体校正和分离以及后期纺缍体的稳定等[3]。

　　近年来，研究发现：CENP-F在许多恶性肿瘤中过度表达，表明在肿瘤发生时存在细胞分裂的增加和细胞分裂周期中调节功能的异常。De La Guardia等[4]用RT-PCR技术发现了头颈鳞状细胞癌中CENP-F的基因扩增和过度表达，并认为癌细胞的转移与CENP-F过度表达有关。Esguerra等[5]用免疫组化技术在颊齿龈鳞状细胞癌组织中发现了CENP-F过度表达，认为CENP-F可作为恶性肿瘤细胞增殖的标志物。Shigeishi等[6]通过对唾液腺癌的研究也认为CENP-F表达与恶性条件下肿瘤细胞的增殖有紧密联系。对于CENP-F与脑胶质瘤的关系，Korkolopoulou等[7]研究认为CENP-F可作为星形细胞瘤增殖的标志物。Van den Boom等[8]发现CENP-F在弥漫性胶质瘤中过度表达。目前，对CENP-F在良性肿瘤中的表达以及二者之间的关系的研究报道较少。本实验发现：CENP-F在脑膜瘤中表达显著高于正常脑组织，而且随着肿瘤病理分级的增加，CENP-F表达的阳性率和表达水平也增高 (P <0.05)。这与CENP-F在恶性肿瘤中的研究结论[6，9]基本一致。这些结果提示：CENP-F过度表达与脑膜瘤的生成及肿瘤细胞的增殖具有一定联系。

　　我们推测：CENP-F过度表达对有丝分裂不恰当的调节促进了人类肿瘤的生成及增殖。CENP-F表达异常使着丝点聚集和纺缍体检查点功能紊乱，导致染色体运动和分离障碍，引起细胞分裂后染色体的非整倍性增加，出现单倍体、三倍体、四倍体等改变，促进肿瘤的发生。Cahill等[10]认为染色体不稳定性 (CIN) 导致了异常染色体数目 (非整倍性)，并在实验中发现了CIN细胞株中有丝分裂检查点的缺陷。而在肿瘤细胞中，CENP-F过度表达增强了有丝分裂活性，促进了染色体不正确分离，使有缺陷的染色体分离至子细胞，造成正常遗传物质的丢失，增加了肿瘤的增殖活性，而肿瘤增殖活性的增加又促进了CENP-F蛋白的表达，使肿瘤不断发展。

　　综上所述，CENP-F的过度表达可能参与了脑膜瘤的生成及增殖过程，通过检测脑膜瘤的CENP-F水平并结合其临床病理特征可能有助于我们对肿瘤的生物学行为和预后进行评价。近年来的一些研究表明：利用RNAi技术抑制CENP-F表达可明显影响有丝分裂进程，甚至导致细胞死亡[3，11]。所以，将CENP-F作为靶点的RNAi技术可能成为未来脑膜瘤治疗的方法之一。

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