胶质瘤U251细胞中CD133表达及干细胞特性分析

　　作者：杨伟现1,欧阳琦2,周月鹏2,王存祖1　　作者单位：1.江苏大学附属医院神经外科; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院

　　【摘要】 目的： 探讨CD133+细胞的生物学特性，分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。方法： 利用免疫荧光染色检测U251细胞中CD133、巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶( NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)等蛋白表达，分析CD133+细胞与CD133-细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞存在的差异。结果： U251中CD133+细胞比例为0.060±0.003，在CD133+细胞中，巢蛋白阳性细胞，NSE和GFAP阴性细胞比CD133-中明显增多;在CD133-细胞中，也存在巢蛋白阳性细胞，数目较CD133+中明显减少，相反巢蛋白阴性细胞，NSE和GFAP阳性细胞明显增多。结论： 胶质瘤U251细胞存在CD133+细胞，在CD133阳性和阴性细胞中，均存在干细胞样细胞，但是在CD133+细胞中此类细胞更多。

　　【关键词】 胶质瘤;CD133+细胞;肿瘤干细胞

　　[Abstract]　Objective： To explore the biological characteristics of CD133 + cells and analyze the feasibility of CD133 as the marker in glioma stem cells. Methods： The expression of CD133， nestin， neuron-specific enolase (NSE)， glial fibrillary acidic protein (GFAP) were detected by immunofluorescence in U251 glioma cells. The differences of the nestin， NSE， GFAP-positive cells were analyzed between CD133 + cells and CD133-cells. Results： In the U251 cells， the CD133+ cells composed to 0.060±0.003. In CD133+ cells， nestin-positive cells， NSE and GFAP-negative cells increased significantly; in CD133- cells， on the contrary， nestin negative cells， NSE and GFAP positive cells increased significantly. Conclusion： The CD133+ cells exist in U251 glioma cells， which have stem cell characteristics.

　　[Key words]　glioma; CD133+ cells; cancer stem cells

　　Singh 等[1]研究发现脑肿瘤中几乎所有的细胞均由一小部分表达人类干细胞标志物CD133+细胞产生，即脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell，BTSC)。BTSC具有以下生物学特性：① 在体外神经干细胞培养条件下形成细胞球，呈悬浮球样生长;② 具有自我更新和无限增殖能力;③ 能够多向分化成为各种肿瘤表型细胞，接种至免疫缺陷动物后能够致瘤，形成的肿瘤与中枢神经系统肿瘤干细胞来源肿瘤表型一致即具有亲本性;④ CD133、巢蛋白(nestin)、RNA结合蛋白musashi-1(Msi-1)、转录因子Sox2[sex determining region of Y(SRY)-related high-mobility group(HMG)box 2]、乳腺癌耐药蛋白1(breast cancer resistance protein 1，BCRP1) 和(或)三磷腺苷结合盒转运子G2(ATP-binding cassette，sub-family G，member 2，ABCG2)等标记表达阳性。其中CD133是目前用于分离和研究肿瘤干细胞最为普遍的标记之一[2-4]。目前CD133+细胞是否一定为胶质瘤干细胞，CD133-细胞中是否就一定不含有干细胞尚无明确的结论，存在着较大的争议。本研究通过检测胶质瘤U251细胞中CD133表达，探讨CD133阳性和阴性细胞的干细胞特性，分析CD133作为肿瘤干细胞标记的可行性。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　DMEM低糖培养基、特级胎牛血清、DMSO、胰酶等购于Gibco公司;巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE )、神经胶质细胞纤维酸性蛋白( GFAP)等鼠抗人单抗购于NeoMarkers公司;CD133(AC133)、羊抗鼠 IgG(二抗)、FITC、TRITC等购于Miltenyi公司;人脑胶质瘤U251细胞株购于上海生命科学研究所细胞库;荧光显微镜(Leica)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞培养

　　用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养U251细胞，置CO2 培养箱内(37℃，5%CO2 )培养。当细胞铺满培养瓶底壁时进行消化、传代。

　　1.2.2　CD133+细胞检测

　　细胞接种于24孔培养板中，贴壁进入对数生长期后，用4%的低聚甲醛固定，3%BSA 4℃封闭30 min，分别加入CD133单抗，放入4℃冰箱过夜。第2天用PBS漂洗3次后，加入FITC荧光标记的二抗，37℃水浴箱温热2 h，经Hoechst33342复染后，PBS漂洗3次，甘油封片后置荧光显微下观察并摄片，FITC荧光波长取490 nm。

　　1.2.3　巢蛋白、NSE、GFAP检测

　　采用免疫荧光染色检测巢蛋白、NSE、GFAP，每个指标重复3次，方法同“1.2.2”，其中二抗为TRITC标记，激发光波长为550 nm。

　　1.2.4　Hoechst33342复染

　　上述各培养孔在加入二抗后，再加入2.5 mg/ml Hoechst 33342 1 ml置37℃水浴箱中染色30 min。

　　1.2.5　阳性细胞判断及结果分析

　　阳性细胞判断：CD133阳性为细胞膜出现绿色荧光，NSE，GFAP，巢蛋白等阳性为细胞质中出现红色荧光。Host33342复染后，阳性细胞为细胞核出现蓝色荧光。

　　结果分析：请病理科医生读片，计数3个重复孔，每孔取5个不同视野，计数1 000个以上细胞中阳性细胞个数，计算阳性细胞率。

　　1.2.6　统计学处理

　　数据用SPSS17.0处理，阳性及阴性细胞比例比较采用均数±标准差表示，CD133+和CD133-细胞间巢蛋白、NSE、GFAP阳性比例比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　胶质瘤U251中CD133细胞阳性率

　　CD133+胶质瘤U251细胞的胞体及突起为强烈的绿荧光，并覆盖胞核。细胞形态以圆形或类圆形为主，且有聚集成簇现象(图1)，比例为0.060±0.003。图1　CD133在U251细胞中的表达情况

　　2.2　CD133+细胞中巢蛋白、NSE、GFAP的表达

　　巢蛋白、NSE、GFAP阳性细胞均为红色荧光标记，荧光表达在细胞质中，同时表达绿色和红色荧光的为双阳性细胞，见图2。CD133+细胞中有约45.1%的细胞巢蛋白表达阳性，NSE和GFAP大部分却表达阴性;相反，在CD133-细胞中只有少部分细胞巢蛋白表达阳性，NSE和GFAP的表达却很高。CD133+和CD133-细胞中巢蛋白、NSE、GFAP阳性的比例见表1，CD133+和CD133-细胞中上述3个指标相互比较具有统计学意义，提示CD133+细胞中具有干细胞特性的细胞比例较CD133-细胞明显增高。图2　CD133+细胞中巢蛋白、NSE和GFAP的表达情况表1　CD133+细胞中巢蛋白、NSE和GFAP阳性细胞比例

　　3　讨论

　　CD133 蛋白最早在 1997 年以 AC133 抗原的形式被人们发现，而 AC133 抗原实际上只是CD133 的一个糖基化表位(epitope)，它选择性地表达于人 CD34+ 造血干细胞及前体细胞中[5]。而胶质瘤是最早被发现含有CD133+肿瘤干细胞的实体肿瘤之一。从人脑胶质瘤中分离出的CD133+细胞在体外有干细胞特性(自我更新、多向分化以及成球生长)，并在动物体内具有成瘤性[6-7]，研究发现，100 个CD133+细胞即可在鼠脑中形成肿瘤并能进行连续传代移植，而即使多达105 个CD133-细胞也不能生成肿瘤[8]，由此可见CD133+细胞具有干细胞特性。在一组95例胶质瘤患者中发现，CD133+细胞的比例以及其聚集成簇的分布特点与患者生存率密切相关，是独立于肿瘤级别、切除范围及患者年龄之外的另一重要预后因素，同时还是影响肿瘤复发及恶性进展的独立危险因素[9]。该组资料提示CD133表达与患者预后之间有直接联系， 进一步证实了CD133+胶质瘤干细胞的存在。

　　然而， 对于CD133+细胞是否是干细胞还有诸多争议， 越来越多的研究发现了CD133-胶质瘤干细胞的存在。在部分新鲜恶性胶质瘤标本以及大多数胶质瘤细胞系中检测不到CD133的表达[6， 10]，说明存在CD133+细胞以外的CD133-细胞能够维持肿瘤生长和具有成瘤能力。另外，不同患者来源的恶性胶质瘤细胞在体外经无血清培养后可生成两种不同CD133表型的细胞，即部分胶质瘤含有CD133+肿瘤干细胞，另一部分胶质瘤干细胞其CD133表型为阴性，两者均具备干细胞特性和成瘤能力， 且都可再次生成CD133+及CD133-细胞群[6， 10]。由CD133+肿瘤干细胞生成的CD133-细胞并不具有成瘤能力，提示其本质上有别于原代CD133-肿瘤干细胞[11]。这些研究结果表明CD133-细胞中也可能存在胶质瘤干细胞。

　　本研究通过免疫荧光的方法检测胶质瘤U251细胞中CD133的表达情况及CD133+细胞中巢蛋白，NSE，GFAP等蛋白的表达情况，以探讨CD133+细胞的干细胞特性并分析CD133作为胶质瘤干细胞标记的可行性。结果发现在胶质瘤U251细胞中，CD133+细胞的比例为0.060±0.003，其中CD133+细胞中巢蛋白阳性细胞的比例为0.451±0.026，而CD133-细胞中巢蛋白阳性细胞的比例为0.074±0.015，这表明胶质瘤U251细胞中存在CD133+细胞，大部分CD133+细胞表面巢蛋白表达阳性，而巢蛋白是目前公认的脑肿瘤干细胞表面标记之一，由此可知这类细胞具有干细胞特性;然而实验结果表明少部分CD133-细胞表面巢蛋白表达也是阳性，这说明部分CD133-细胞同样具有干细胞特性。同时我们的实验结果表明大部分CD133+细胞NSE和GFAP都表达阴性，相反大部分CD133-细胞表面NSE和GFAP都表达阳性，由此可见，在胶质瘤U251细胞中大部分CD133+细胞具有肿瘤干细胞特性，但是，由于少部分CD133-细胞同样具有干细胞特性，故CD133能否作为脑肿瘤干细胞表面标记还有待商榷。

　　综上所述， 尽管CD133近年来受到越来越多的质疑，但是，它仍然是该领域中研究得最多且应用最广泛的胶质瘤干细胞表面标记之一。由于 CD133-肿瘤干细胞的存在，并可能代表着更为原始的干细胞表型，以及 CD133本身尚不明确的生物学功能和对其糖基化表位特异性的争议，在肿瘤干细胞的鉴定中，CD133可以作为标志物之一，但应联合应用其他标志物。有研究表明，高迁移率族蛋白A1(HMGA1)可能是胶质瘤一个潜在的生物学标志物[12]，但是HMGA1能否作为鉴别胶质瘤干细胞的标记有待进一步研究。总之，在胶质瘤干细胞今后的研究中，继续寻找肿瘤干细胞特异性更高的标志物是亟待解决的问题。

　　【参考文献】

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　　[12] Fan H， Guo H， Zhang IY， et al. The different HMGA1 expression of total population of glioblastoma cell line U251 and glioma stem cells isolated from U251 [J]. Brain Res， 2011,1384(4)：9-14.