神经生长因子在NCI-H466细胞中的表达及其生物学意义

　　作者：樊玉龙1,2,袁志诚1,杨勇1　　作者单位：1.江苏大学附属人民医院神经外科;2.江苏大学临床医学院;3. 江苏大学基础医学与医学技术学院

　　【摘要】 目的： 探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在小细胞肺癌细胞株NCI-H466中的表达及肺癌脑转移的可能机制。方法： 采用免疫荧光标记技术观察人小细胞肺癌NCI-H466细胞中NGF的亚细胞定位表达，并采用MTT试验及Transwell试验观察NGF对NCI-H466细胞增殖及侵袭能力的影响。结果： NGF在NCI-H466细胞中亚细胞定位表达存在细胞周期特异性，在分裂间期，NGF主要呈颗粒状分布于细胞核内;在分裂中期，NGF分布于纺锤丝上。加入外源性NGF的NCI-H466细胞增殖明显加速，侵袭能力增强。结论： NGF可以促进NCI-H466细胞增殖和迁移，中枢神经系统内高NGF水平可能是肺癌易于发生脑转移的原因之一。NGF在肺癌细胞内具有亚细胞定位表达的特点，有可能作为一种新的治疗靶点。

　　【关键词】 神经生长因子; 小细胞肺癌; 脑转移癌

　　[Abstract]　Objective： To observe nerve growth factor (NGF) expression in small cell lung cancer cell line NCI-H466， and explore the possible machanism of its brain metastasis. Methods： Subcellular expression of NGF in NCI-H466 was observed by immunofluorescence staining. MTT and transwell assay were used to evaluate the proliferation and invasion of the cell treated by NGF. Results： The subcellular localization of NGF was cell cycle specific. NGF was located in the nuclei at interphase and on spindle at mitotic phase. Administration of NGF promoted the cell proliferation and invasion. Conclusion： the dependence on NGF may account for the tendency of brain metastasis. The subcellular localization of NGF may be explored as a new target for therapy.

　　[Key words]　nerve growth factor; small cell lung cancer; brain metastatic tumor

　　颅内所有的肿瘤中大约有20%～40%来自颅外肿瘤的转移，而在这些转移肿瘤中肺癌又占了将近50%[1]，小细胞肺癌占肺癌的比例大约是20%～25%，约有20%的小细胞肺癌患者在被诊断时已有脑转移，小细胞肺癌颅内转移率约0.4%～1%，而在小细胞肺癌患者的死亡病例尸检中脑转移发生率高达80%。小细胞肺癌是一种恶性程度高并具有神经内分泌功能的肿瘤[2]，有研究表明小细胞肺癌可以分泌神经营养因子(neurotrophin，NT)，包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性的神经营养因子(brain derived neurophic factor， BDNF)、神经营养因子-3 (NT-3)等[3]。这些神经营养素在正常及受损的中枢神经系统中均有表达，是维持正常的中枢神经系统结构和功能必不可少的因子。为了探讨小细胞肺癌颅内转移的“偏好”及其生物学机制，本试验拟选择小细胞肺癌细胞株NCI-H466作为研究对象，采用免疫荧光标记技术观察NCI-H466细胞中NGF的亚细胞定位表达，并采用MTT及Transwell试验观察NGF对NCI-H466细胞增殖及侵袭能力的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　NCI-H466细胞培养

　　人小细胞肺癌细胞株NCI-H466(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所提供)，用含10%胎牛血清的DMEM(Gibco)培养液，37℃，5% CO2饱和湿度培养，传代备用。

　　1.2　NGF在NCI-H466细胞内的免疫荧光染色

　　取对数生长期细胞以104/ml密度接种铺有小圆盖片的24孔板，用10%胎牛血清DMEM的培养液培养，36 h后用4%低聚甲醛固定6 h。

　　将上述固定后的细胞用PBS漂洗3遍，加入3%的牛血清白蛋白(BSA)和0.25% Triton， 37℃放置30 min，然后加入1 ∶200稀释的兔抗NGF多克隆抗体(Santa Cruz H20),4℃冰箱过夜，次日取出37℃孵育3 h，PBS漂洗3遍，加入1 ∶300稀释的Cy3标记的羊抗兔IgG(Sigma),37℃孵育1 h。用PBS代替一抗进行免疫荧光染色阴性对照试验。免疫荧光染色后，用蓝色荧光素Hoechst33342(Sigma)标记细胞核。染色后用激光共聚焦显微镜(Leica)观察结果并拍照。

　　1.3　MTT法检测外源性NGF对NCI-H466细胞的影响

　　取对数生长期的细胞以104/ml,100 μl/孔接种96孔板2块，培养12 h后吸去培养液，将其分为对照组、外源性NGF组，以含10%胎牛血清的DMEM培养液、含100 ng/ml人重组β-NGF的完全培养液，37℃ 5% CO2饱和湿度继续培养，分别于培养0,1,2,3,4,5,6,7天每组培养板中各取出一列，加入MTT(5 mg/ml),20 μl/孔，反应4 h后吸去培养液，加入10% SDS-0.01 mol/L HCl,100 μl/孔，待实验结束后一起用酶标仪于570 nm处读取D值，统计处理后做细胞生长曲线。

　　1.4　Transwell实验检测外源性NGF对NCI-H466细胞侵袭力的影响

　　制备细胞悬液前先让细胞无血清饥饿12 h，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗3遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至2×105，取细胞悬液100 μl加入Transwell小室(孔径8 μm),24孔板下室分别加入500 μl不含β-NGF DMEM培养基(不含胎牛血清)、含100 ng/ml人重组β-NGF DMEM培养基，37℃ 5% CO2饱和湿度培养48 h。将膜取出，用棉签擦除小室侧的细胞，下室面用Gimsa染色，用激光共聚焦显微镜观察结果并拍照。

　　2　结果

　　2.1　细胞周期不同时相NCI-H466细胞内的NGF分布特点

　　免疫荧光染色结果显示，NGF在小细胞肺癌细胞NCI-H466中高表达，且其亚细胞定位存在细胞周期特异性。除了在各细胞周期中，NGF在细胞质中均有弥散分布外，NGF在分裂间期主要呈颗粒状定位于细胞核内(图1双线箭头)，中期 NGF主要定位于纺锤丝上(图1单线箭头)。a：NGF在细胞胞质、胞核分布;b：NGF在细胞核分布图1　NGF在NCI-H466细胞周期中不同时相的免疫荧光染色结果

　　2.2　外源性NGF对NCI-H466细胞生长的影响

　　在含有100 ng/ml β-NGF的培养条件下，NCI-H466细胞增殖明显加快，分裂象增多，到达平台期的时间明显缩短(实验组到达平台期是3～4 d，对照组到达平台期是5 d，见图2)，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。图2　外源性NGF对NCI-H466细胞生长的影响

　　2.3　外源性NGF对NCI-H466细胞侵袭能力的影响

　　在含有100 ng/ml β-NGF的培养条件下，穿膜NCI-H466细胞明显增多(图3、4)，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。图3　倒置显微镜观察外源性NGF对NCI-H466细胞侵袭能力的影响图4　外源性NGF对NCI-H466细胞侵袭能力的影响

　　3　讨论

　　随着社会的发展，环境污染日益严重，肺癌的发病率越来越高，5年存活率低于15%。肺癌脑转移是颅内最常见的转移瘤、是肺癌治疗失败的常见原因之一。据近年文献记载，小细胞肺癌不治疗者中位生存期只有4周，全脑放疗中位生存期3～6个月，单纯外科手术治疗中位生存期约为5个月。Dolle等[4]研究证实，14%具有神经浸润的肿瘤出现局部复发，而无神经浸润者无复发。多种因子参与该过程，NGF可能就是其中重要的一员。NGF可以促进肿瘤的生存、生长、浸润、转移[5-11]。为了探讨小细胞肺癌脑转移的“偏好”是否与中枢神经系统中高表达的NGF有关。本试验中我们观察NGF对小细胞肺癌生长的影响及其亚细胞定位表达。

　　免疫荧光染色结果显示，NGF在小细胞肺癌细胞NCI-H466中高表达，且其亚细胞定位存在细胞周期特异性。除了在各细胞周期中，NGF在细胞质中均有弥散分布外，NGF在分裂间期主要呈颗粒状定位于细胞核内;中期 NGF主要定位于纺锤丝上。张志坚等[12-13]研究发现，NGF在胶质瘤细胞株U251细胞中亦存在周期性分布的特点，NGF在U251细胞内的多靶点作用模式有助于节省细胞的能量，最大限度发挥NGF的生物学作用，促进肿瘤细胞的分裂增殖。因此，我们推测，NGF在小细胞肺癌细胞株NCI-H466中的亚细胞定位表达特点亦有重要的生物学意义。我们采用外源性NGF处理NCI-H466细胞，通过MTT及Transwell试验观察到，在含有100 ng/ml β-NGF的培养条件下，NCI-H466细胞增殖明显加快，侵袭能力增强。因此，NCI-H466细胞不仅自身可以表达高水平的NGF，且外源性NGF可以明显促进其增殖和侵袭，我们推测中枢神经系统是NGF的富集区，较高的NGF水平可能会趋化小细胞肺癌细胞，并且使得入侵的癌细胞能够存活增殖，形成转移灶。NGF在小细胞肺癌中的表达特点可能作为治疗的新靶点。

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