犬梭形动脉瘤生物膜包裹的远期血流动力学对照研究Ⅱ——组织形态学观察

　　作者：张文清　漆松涛　安胜利　杨璇　　作者单位：南方医科大学 1. 南方医院神经外科; 2. 统计学教研室; 3. 南方医院影像中心; 广东 广州 510515

　　【摘要】目的 分析犬梭形动脉瘤 (FFA) 模型在采用生物膜包裹后1年期的血流动力学与组织学变化，探讨生物膜包裹的远期效果。 方法 对10只犬采用显微手术制作双侧梭形动脉瘤模型20枚，左侧用生物膜完全匹配包裹，右侧未包裹以作为对照，行DSA、彩色多普勒超声动态检测，对照观察两组的血流动力学变化特征。术后1年时行活体解剖取标本，对照观察组织学变化。 结果 所有模型均制作成功。FFA腔内为涡流，多普勒超声具有特征性的双相涡流频谱，造影剂滞留明显;对照侧术后1年膨胀性增大，并具有自发破裂的趋势。手术侧包裹后瘤腔消失，血流恢复为层流，超声频谱与颈总动脉一致，未见造影剂滞留，血管顺应性、弹性及舒缩状态与颈总动脉基本匹配;瘤腔与吻合口处的血流动力学参数差异有统计学意义 (P <0.05)。组织学改变与血流动力学变化相。 结论 犬FFA模型是研究包裹治疗的理想动脉模型，采用生物膜完全匹配包裹，远期效果良好。

　　【关键词】 颅内动脉瘤　生物膜　包裹　血液动力学过程　组织学

　　Hemodynamics and histomorphology study in long-term by the matched control of the fusiform aneurysm and the wrapping withbiological graft in venous auto graft canine models

　　ZHANG Wenqing1, QI Songtao1, AN Shengli2, et al

　　1. Department of Neurosurgery, Nanfang Hospital; 2. Department of Biostatistics, Southern Medical University, Guangzhou　510515, China

　　Abstract: Objective To analyze the changes in the hemodynamics and histomorphology of the canine fusiform aneurysm(FFA) models in twelve months after being wrapped by biomembrane, and explore the long-term effect of the biomembrane. Methods　 Twenty fusiform aneurysm models were established in the bilateral common carotid artery in 10 dogs as experimentalanimals by microsurgical techniques. The left side models were wrapped in perfect match state with biomembrane asexperimental group and the right side models as blank control group. Hemodynamic alterations between the two groups werecompared by color Doppler and digital subtraction angiography within twelve months. The histomorphological changes were　observed by light microscope in the twelve months after the operation. Results All the models were created successfully.Turbulent flow formed in the FFA cavity and was of characteristic double phase frequency spectrum with significant stagnation　of contrast medium. The aneurysm enlarged and could come to rupture one year after the operation in the control side. In theside where the tumor was wrapped with biomembrane, the tumor cavity disappeared, the blood flow was recovered as laminarflow, the frequency spectrum was consistent with that of the common carotid artery, and no stagnation of contrast medium was　seen. The complaisance, elasticity and contractility of the vessel were similar to those of the common carotid artery. There　were significant differences in hemodynamic prameter of the aneurysm cavity and stoma between the two groups (P<0.05).Histological changes corresponded to hemodynamic alterations. Conclusion The long-term therapeutic efficacy of wrapping　fusiform aneurysm with biomembrane is good. And FFA models may be helpful for further research of wrapping treatment oftumors.

　　Key words: intracranial aneurysm; biofilms; wrapping; hemodynamic processes; histology

　　颅内梭形动脉瘤 (FFA) 病因尚不明确，其治疗相当棘手[1]。本研究采用犬颈外静脉 (EJV) 嫁接颈总动脉 (CCA) 制作双侧FFA模型，左侧作为实验组用生物膜[2]进行完全匹配包裹治疗，右侧作为对照组未包裹。术后1年内，行DSA、彩色多普勒超声等动态检测，观察双侧模型血流动力学的特征性变化;1年时活体解剖取标本，组织学观察，分析FFA的发生、发展机制与组织学变化，探讨生物膜包裹治疗的长期有效性与稳定性。

　　1 材料与方法

　　1.1 犬嫁接性FFA模型的制作

　　成年健康杂种犬10只，体质量15～18 kg。全麻，取甲状软骨下缘到胸骨上缘正中切口，显露左侧EJV与CCA，剥离外膜组织，于同一平面切除1.5 cm CCA，截取EJV 1.5 cm，远近端倒置，显微镜下行连续外翻无渗血吻合嫁接于CCA。观察动脉搏动良好，通过勒血实验确认通畅。同法制作右侧模型[3]。

　　1.2 包裹治疗方法

　　根据多数学者的研究结果，自体静脉移植后第6周，其血流动力学和病理改变与人类颅内动脉瘤生理特性相类似[3-5]。此时取左侧模型，仔细解剖、剥离瘤壁及CCA外周结缔组织，采用生物膜 (厚度0.04 cm) 进行完全匹配状态下包裹治疗。包裹方法：生物膜圆周包绕动脉瘤，松紧度为包绕后管状内径与CCA的外径相匹配，5-0无损伤缝合线缝合生物膜两端。包裹范围为FFA全长+远近端CCA各0.5 cm (图1，2)。

　　1.3 血流动力学检测

　　动物全麻，GE LOGIQ BOOK全数字电脑声像仪，线阵探头，中心频率5~10M Hz。TCD频率5.5M Hz。TCD检查时滤波频率100 Hz，声束和血流夹角<60°，采用局部放大测量双侧模型的近远端吻合口径、瘤腔和CCA收缩期管径与壁的厚度。彩色血流观察血流状态与涡流，脉冲多普勒取样测量观测部位收缩峰血流速度 (Vs)、舒张期末血流速度 (Vd)、阻力指数 (RI) 和特征性频谱，计数收缩峰与舒张期末血流速度比值(S/D)，连续测定3个心动周期取平均值。随后送DSA 室，应用美国通用公司GE 9800数字减影血管造影仪，经右侧股动脉插管行双侧CCA造影。设定参照物 (直径0.6 cm)，以8.3帧/s的速度计算造影剂在瘤腔中的滞留时间。

　　1.4 组织学观察

　　包裹后第12个月，动物全麻活体解剖观察后，留取动脉瘤处标本，10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，分别进行苏木精-伊红染色和PAS特殊染色 (细胞质内的糖原颗粒及组织中的黏多糖类物质淡染成樱桃红色，含量越高则染色越深;蛋白质胶元被深染成紫红色)。

　　1.5 统计学分析

　　数据均以均数 ± 标准差 (x ± s) 表示，采用SSPS10.0软件包进行统计处理，组间、组内比较均采用单因素方差分析，以P <0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 血流动力学检测

　　10只犬全部健康存活，实验组包裹治疗成功率为100% (10例)，对照组 FFA模型均明显增大，1年内两组均无狭窄、栓塞、自发破裂。通畅情况与DSA检查结果符合率为100%。

　　对照组TCD观察瘤腔内为涡流，纵切见“五彩镶嵌”血流，CCA为红色层流 (图3)。二维声像图均为形态良好的梭形，与1年前[3]比较，长度无明显改变，宽度增大明显，平均46.5%;远近端吻合口斑块增生、重塑，厚度明显大于动脉壁，有瘢痕化趋向;瘤壁远近端厚度接近CCA壁，移行至中间部分最薄，明显小于动脉壁;脉冲多普勒测量远近端CCA与瘤腔内各点的血流参数 (表1) 差异有统计学意义 (P <0.05);瘤腔内血流呈双相涡流频谱 (图4)。DSA示瘤腔内为涡流，造影剂通过瘤近端吻合口时，速度骤然加快而大部分呈束状通过瘤体中轴，迅速流入远侧CCA，小部分撞击到远端吻合口侧壁，沿瘤壁逆中轴血流方向高速旋转，反流向瘤腔近端，在中轴两侧瘤腔先形成较小的涡流，从瘤壁近端旋出时，在中轴血流的冲击下，再在整个瘤腔内加速汇合成大的涡流，滞留时间 (3.65 ± 0.18) s，与1年前的 (2.35 ± 0.14) s比较[3]，明显延长。血流动力学指标测量结果与彩色超声结果相似 (图5)。

　　实验组TCD观察生物膜包裹后瘤腔消失，顺畅塑型内径与CCA接近;包裹瘤腔内未见“五彩镶嵌”的涡流，代之以与近远端CCA延续良好的中轴桔红鲜亮、周边鲜红色的层流，瘤腔内及吻合口无斑块造成的充盈缺损血流显像 (图6)。二维声像图观察，与1年前[3]比较，长度无明显改变，宽度无扩张膨大的趋向，远近端吻合口斑块未见明显增生，反而顺应CCA移行重塑，厚度接近CCA;瘤壁厚度远近端与中间部分均匀一致，稍薄于CCA壁。脉冲多普勒测量远近端CCA与包裹瘤腔内各点的血流参数稳定 (表1)，无异常高速血流及反向频谱 (图7)。实验组不同观察部位的Vs、Vd、RI和S/D差异均无统计学意义 (P >0.05);与对照组比较，瘤腔与吻合口处的Vs、RI和S/D差异均具有统计学意义 (P<0.05)。DSA检查显示包瘤腔内为层流 (图8)，与1年前[3]比较，血管内壁更加光滑，无狭窄、扭曲、闭塞。造影剂随着血流顺畅快速通过而无滞留。血流动力学指标测量结果与彩超相似。

　　2.2 组织学观察

　　2.2.1 活体解剖：

　　对照组动脉瘤大小1.45～1.50 cm × 0.80～1.10 cm，外表与周围组织膜性黏连，新生滋养血管长入;截取标本纵形剖开，瘤腔内壁光滑，内膜明显增厚，未见附壁血栓及静脉瓣，缝合线头可以辨认;远近端吻合口处见隆起的增生斑块，平均厚度：远端为0.16 cm，向瘤腔内瘤壁延伸移行;近端为0.12 cm，未向瘤腔内瘤壁延伸移行;瘤壁中间为0.06 cm，CCA壁为0.08 cm (图9)。在生物膜包裹后，瘤体形态与CCA延续良好，外表与周围组织膜性黏连，新生的滋养血管长入;剥离膜性组织，瘤体长度1.45～1.50 cm，直径0.45～0.5 cm，CCA直径0.40～0.45 cm;生物膜色泽与动脉外膜相似，呈半透明状，透过生物膜可以看见两端吻合口处的线头;截取标本纵形剖开，可见包裹瘤腔内壁光滑，内膜与动脉延续良好，并无增厚，未见附壁血栓及静脉瓣，缝合处线头清晰;远近端吻合口处未见隆起的增生斑块，平均厚度：远端0.10 cm，近端为0.10 cm，瘤壁中间为0.08 cm，CCA壁为0.8 cm (图10)。

　　2.2.2 病理：

　　对照组动脉瘤腔面内皮完整，内膜明显增厚，内弹性层断裂，中膜、新生外膜层增厚，分界不清，滋养血管及增生的弹性纤维和胶原纤维多，大量平滑肌细胞增殖。在动脉瘤不同部位，内膜改变不同：远近端斑块内皮光滑完整，内皮下层明显增厚，胶原纤维密集互连成网，成纤维细胞与纤维细胞大量增生，平滑肌细胞较少，可见炎症细胞浸润，未见内弹性膜及弹力纤维，表现为致密结缔组织化;瘤壁中间部分可见内皮细胞损伤、脱落;内皮下层明显增厚，平滑肌细胞向内膜迁移和大量增殖, 排列紊乱，细胞外基质堆积，可见少量弹性纤维和胶原纤维，炎性细胞浸润 (图11)。

　　实验组进行生物膜完全匹配包裹后，内皮光滑完整，内皮下层无明显增厚，内弹性层较薄，少量弹性纤维和胶原纤维及平滑肌细胞，排列规则，其间隙处可见成纤维细胞与纤维细胞生长，偶见炎症细胞浸润。中膜薄，新生外膜可以看见滋养血管及排列规则的弹性纤维和胶原纤维，少量平滑肌细胞。包裹的生物膜外层已经降解，被新生弹性纤维和胶原纤维所替代，外表维持原型;瘤壁外膜与生物膜交界处及生物膜内部可以看见降解间隙，其内可以看见新生平滑肌细胞、纤维细胞及毛细血管组织，未见炎症细胞浸润 (图12)。

　　3 讨 论

　　3.1 包裹治疗的现状

　　FAA由动脉管壁梭性扩大而形成，因缺乏明确的瘤颈，或有重要的穿通动脉、分支血管，常规瘤颈夹闭或载瘤动脉闭塞手术极为困难[1，4];其自然预后较差，再次出血率明显高于一般囊性动脉瘤，因此更需要探讨新的治疗方法[5]。在体研究受到许多限制，近年来人们试图通过动脉瘤动物模型研究来揭示 FFA的发生、发展机制，并探讨最适合的治疗方法。但如何设计和制作长期、稳定、可靠、重复性强且血流动力学与人体动脉瘤生理特性相一致的FFA模型，仍是开展此类研究的难点。实验研究发现：犬EJV嫁接性FFA模型的血液动力学和影像学特点接近于人类[3]。

　　对于夹闭和血管内栓塞均棘手的颅内动脉瘤，外部包裹无疑是选择之一[6]。随着包裹技术的不断发展，现已研制出不同的包裹材料，并建立了各种包裹方法。但是，目前对包裹治疗的动物模型、包裹材料和方法等优缺点的实验研究，主要依据术后短期的影像学及组织学观察[7]，对模型的长期可靠性、血流动力学与动脉瘤的发展机制缺乏远期研究，而临床对包裹方法与材料的长期有效性与稳定性仅仅依赖于回顾性分析[6，8]。术后远期的影像学、血流动力学及组织学动态追踪研究尚未见报道。

　　3.2 血流动力学与组织学适应性改变

　　3.2.1 FFA血流动力学与组织学特征：

　　犬正常CCA血流为规律层流，Vd与Vs相差大，频谱特征为单向层流频谱。

　　本组FFA模型TCD显示瘤腔内各部位均为涡流，Vs明显低于CCA和吻合口的血流速度，Vd极低或测不到，频谱形态表现异常：其收缩峰陡峭高尖并出现负向血流频谱，舒张期三峰消失。血流特征呈双相涡流频谱：收缩峰高尖、不规则，收缩末期出现低而宽的负向波，此为静脉管壁的顺应性和弹性差，收缩期动脉收缩，轴心血流灌注瘤腔，而瘤腔舒张使回流加速所致;舒张期断流，频谱消失，此为舒张期瘤腔内压高于动脉，涡流的旋转反流部分或完全抵消轴心血流所致。

　　组织学观察：①远端斑块厚度平均为动脉壁的2倍，并向吻合口两侧瘤壁延伸移行，有瘢痕化趋向，从DSA显像分析，此为吻合口两侧壁受到高速血流撞击，为缓冲血流冲击所产生的适应性反应。近端斑块厚度平均为动脉壁的1.5倍，未向瘤腔内瘤壁延伸移行，此为高速的中轴血流与旋转反流的涡流所致的增生重塑反应。②瘤壁中间部分最薄，平均为动脉壁厚度的2/3。

　　动脉瘤血管壁各层细胞受损、增殖、重塑的原因可能为三方面：①移植静脉管壁血供与弹性纤维含量远远低于CCA，远近端动脉的滋养血管与弹性纤维向瘤腔壁生长，中间部位最薄弱;②移植静脉的血管压力-容积 (管径) 关系的周向顺性减小[9]，瘤腔中间部位的管壁应力最高;③涡流产生的管壁面剪切力最大。瘤腔中间部分Vs、Vd下降而RI与S/D升高，瘤腔内呈高压力状态，导致内皮剥脱、中膜损伤、弹性纤维层被破坏，瘤壁变薄。随着动脉瘤逐渐生长，远近端斑块增生导致瘤腔内的阻力指数进一步增高，瘤腔内压力进一步增大，内皮细胞损伤加重，平滑肌细胞损伤、增殖，炎性细胞浸润，瘤壁重塑的中间部分进一步变薄。

　　3.2.2 包裹后血流动力学与组织学特征：

　　人类颅内囊性动脉瘤的病理特征：在血流的不断冲击下，瘤壁损伤和重塑的过程失衡导致瘤体扩大和破裂[10]。众多学者的研究表明：自体静脉移植后明显扩张，在血液涡流的作用下，第1～4 周管壁逐渐增厚，第4～6 周管壁的厚度达到最大[11]。本组预实验的早期结果与上述研究结果相类似，术后第6周，FFA与人类颅内动脉瘤的生理特性相类似;此时使用生物膜进行包裹，其血流动力学和组织学改变最接近人类颅内动脉瘤的包裹效果[3]。

　　使用生物膜包裹后瘤腔消失，管腔内血流为层流，TCD频谱特征为：收缩峰高尖，下降支陡峭，舒张期较长，三峰低平，切迹不明显的单向层流频谱，未见斑块造成的充盈缺损。血流动力学特征与正常CCA一致。这表明完全匹配状态下的包裹方法，能够适应瘤体及载瘤动脉的特殊形态而顺利塑形包裹，既保持了载瘤动脉的通畅，又避免了包裹的共同缺点：直径太小，动脉将被压缩致狭窄;直径太大，又不能加固动脉壁[6]。

　　组织学观察：①包裹后瘤体内径与CCA匹配;②远近端吻合口未见隆起的增生斑块，瘤壁厚度基本与CCA匹配一致;③内膜、中膜无增厚，结构完整，排列规则，并可见成纤维细胞与纤维细胞生长，组织更加致密、坚韧。尽管腔内动脉血流的管壁高应力持续存在，但未见内皮细胞、平滑肌细胞损伤，这表明完全匹配包裹不仅能够加固薄弱的瘤壁，而且能够抵抗管壁张应力，包裹后血流动力学的改变使得瘤壁重塑结构更加坚固。

　　3.3 生物膜的特点与完全匹配包裹

　　生物膜是采用动物的薄韧膜组织经环氧交联固定、多方位除抗原和偶联多肽与糖胺聚糖配位体的表面活性等处理后制作而成。本实验结果表明：生物膜具有质地柔软、顺应性好、易塑形、机械强度足够的理化性能特点，半透明状的可视性，能在直视下圆周包裹动脉瘤并调节与载瘤动脉的外径完全相匹配，包裹后动脉瘤腔消失，血流动力学恢复正常，早期能够抵抗动脉瘤壁张应力，限制其进一步膨胀，效果良好。1年后，外层已降解，被新生的弹性纤维和胶原纤维替代，其外形、色泽与CCA延续匹配而又维持原形，Vs、Vd、RI与S/D等与CCA基本一致，管壁顺应性良好;瘤壁外膜与生物膜交界处及生物膜内部可见降解间隙，其内可见新生组织生长活跃，未见炎症细胞浸润。这表明生物膜降解产物无免疫排异原性，降解吸收与诱导新生组织细胞的长入、融合是同节奏、正匹配地进行。预计随着观察时间的延长，生物膜的蛋白质胶原将被进一步降解吸收，并诱导机体组织长入，将其逐步蚕食和同化，“新的动脉”完全由自体组织所构成，同时能维持原形、长期有效，这样更加符合生理性的要求[12]。这将是理想的再生医学工程材料，也是动脉瘤包裹治疗的理想材料。

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