实时荧光定量RT-PCR法测定脑胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA表达水平

　　作者：刘维生,耿会娟,王硕,肖新如,陈善　　作者单位：

　　【摘要】目的 探讨胶质瘤恶性程度和MT1-MMP基因mRNA表达水平的关系。 方法 采用实时荧光定量RT-PCR法检测34例脑胶质瘤和7例正常脑组织 (取自癫痫病人手术切除脑组织) 中MT1-MMP的mRNA表达水平。 结果 经实时荧光定量RT-PCR法检测，正常脑组织和低级别、高级别胶质瘤的△△Ct (循环阈值) 值分别为 (0.834 ± 0.517)、(4.063 ± 2.309) 和 (7.072 ± 4.072)。正常脑组织与低级别、高级别胶质瘤之间，低级别、高级别胶质瘤之间MT1-MMP基因mRNA表达水平的差异具有统计学意义 (P <0.05)。 结论 脑胶质瘤中存在MT1-MMP基因mRNA高水平的表达，随着肿瘤恶性级别的增加，MT1-MMP基因mRNA表达水平有增高趋势。

　　【关键词】 神经胶质瘤; 间质胶原酶; 逆转录聚合酶链式反应

　　mRNA expression of MT1-MMP gene in glioma by quantitative real-time fluorescence RT-PCR

　　LIU Weisheng1, GENG Huijuan2, WANG Shuo1, et al.

　　1. Department of Neurosurgery; 2. Department of Clinical Laboratory, Beijing Tiantan Hospital,

　　Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

　　Abstract: Objective To explore the relationship between malignancy of glioma and mRNA expression of MT1-MMP gene. Methods The mRNA expression of MT1-MMP gene in 34 gliomas and 7 normal brain tissues (from epileptic focus resection) was detected by quantitative real-time RT-PCR method. Results By Real-time RT-PCR method，the △△Ct (cycle threshold) values of the normal brain tissue and low-grade, high-grade glioma were 0.834 ± 0.517, 4.063 ± 2.309, and 7.072 ± 4.072 respectively. There was statistical significance of difference between normal brain tissue and low-grade, high-grade glioma, and between low-grade and high-grade glioma (P <0.05). Conclusion The mRNA expression of MT1-MMP gene is up-regulated in glioma, and increases with the malignancy grade of glioma.

　　Key words： glioma; interstitial collagenase; reverse transcriptase polymerase chain reaction

　　脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，但发病机制尚不明确，目前认为其发病与多种基因异常有关。近年研究发现，MT1-MMP基因与多种肿瘤的发生相关。本研究采用实时荧光定量RT-PCR法检测脑胶质瘤标本中的MT1-MMP基因mRNA 的表达情况，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料　　 胶质瘤标本中，男17例，女17例;年龄9～76 岁，平均48.4岁。术前均未行放疗或化疗。胶质瘤标本均经病理证实并按照WHO分级，其中低级别 (Ⅱ级) 12例，高级别22例 (Ⅲ级10例，Ⅳ级12例)。7例正常脑组织标本取自癫痫病人经手术切除的颞前叶脑组织。标本切除后30 min内置于液氮罐内冷冻贮存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 总RNA 的提取：采用Trizol 一步法从冷冻组织中提取总RNA，行琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度仪检测RNA 纯度。

　　1.2.2 mRNA 逆转录成cDNA： 先配制体系A：取总RNA 1 μg，加入Oligo (dT) 1 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μl，再加入焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理的无菌纯水至10 μl，65 ℃ 5 min，迅速插入冰浴中冷却;然后配制体系B：加入10 ×反应缓冲液2 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μl，Rnase Inhibitor 1 μl，RNasin 1 μl，加入DEPC处理的无菌纯水至10 μl。将B管加入A管充分混匀，42 ℃孵育1 h;95 ℃ 5 min 灭活逆转录酶。cDNA 样品于-20 ℃保存备用。

　　1.2.3 检测模板质量，测定内参GAPDH： PCR反应体系为20 μl，以无菌纯水代替DNA 模板作为阴性对照。PCR 反应混合物包括：10 × PCR 缓冲液2 μl，dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μl，上、下游引物 (10 μmol/L) 各0.5 μl，DNA 模板1 μl，Taq 酶0.5 μl，加无菌纯水至20 μl。立即放入冰中混匀，PCR反应过程：94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s, 共30 个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，以标准参照试剂作为对照。目的基因片断为100 bp。

　　1.2.4 荧光实时定量PCR法扩增： 引物序列由北京英骏生物技术有限责任公司合成，以GAPDH作为内参照。GAPDH上游引物序列：5'-CATCCATGAC AACTTTGGTATC-3';下游引物序列：5'-CCATCACGCCACAGTTTC-3'，产物长度为100 bp，退火温度60 ℃。MT1-MMP 上游引物序列：5'-CATCCATGACAACTTTGGTATC-3'，产物长度为112 bp，退火温度60 ℃。下游引物序列：5'-CCCCCATAAAGTTGCTGGATG-3'。PCR反应体系为20 μl，以无菌纯水代替DNA 模板作为阴性对照。PCR 反应混合物包括：包括2 × SYBR 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物 (10 μmol/L) 各1 μl，模板1 μl，其余用无菌去离子水补足。为了增加可信度，每个样品作6个重复管，3管MT1-MMP，3管内参，取平均值。扩增条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，60 ℃ 34 s，76 ℃ 5 min，共40个循环。反应在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行，60 ℃～95 ℃缓慢升温，产生MT1-MMP和GAPDH的溶解曲线 (解离曲线)。

　　1.2.5 结果分析： 实时荧光定量PCR产物利用ABI公司自带的7500 PCR系统软件分析，可观察扩增曲线，并对cDNA的含量进行定量分析，计算样本的△△Ct值 (样本同内参的对数比值)。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS 11.5统计软件包，对胶质瘤标本的性别、年龄、病理类型和病理级别间MT1-MMP mRNA表达进行比较，统计方法采用独立样本t检验和单因素方差分析，以P <0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　实时荧光定量PCR法中，引物的溶解曲线，均未检测到引物二聚体及其他非特异性荧光信号 (图1)。实时荧光定量RT-PCR法检测结果显示，胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA表达明显增高，且有随级别增高的趋势 (表1)。

　　3 讨 论

　　胶质瘤是最常见的原发性神经系统肿瘤，约占原发性神经系统肿瘤的40%～60%，年发病率5～10/10万[1]。因此，从分子水平研究胶质瘤，为临床提供可能的诊断和治疗靶基因显得尤为重要。Sato等[2]于1994 年首先克隆得到MT1-MMP (MMP-14)，其在肿瘤的侵袭、扩散、细胞增殖及血管生成中发挥重要作用。国外研究发现，这种作为前MMP-2激活物的MT1-MMP表达方式可在多种肿瘤中被发现，如肺癌、小肠癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、甲状腺癌、卵巢癌、颈部肉瘤和脑肿瘤。在肿瘤细胞及周围间质细胞中同样检测到转录产物的存在。

　　Forsyth等[3]运用RT-PCR和原位杂交技术对39例胶质瘤、7例正常脑组织和数例其他肿瘤的MT1-MMP mRNA进行检测，发现MT1-MMP mRNA转录产物在正常脑组织中表达很少，而在肿瘤标本中过度表达。Nakada等[4]对6例胶质母细胞瘤进行RNA印记杂交和相关的RT-PCR分析，正常脑组织中未检测到MT1-MMP，而6例胶质母细胞瘤均有MT1-MMP表达。牛光明等[5]采用原位杂交方法检测42 例人脑胶质瘤和8 例正常脑组织中MT1-MMP基因mRNA 的表达，证实MT1-MMP mRNA 的表达和脑胶质瘤的恶性程度呈正相关。张海泉等[6]用免疫组织化学法检测48例人脑胶质瘤组织和10例正常人脑组织中MT1-MMP的表达，表明MT1-MMP在胶质瘤中的表达与其病理学级别有明显的相关性。本研究运用实时定量RT-PCR 技术检测了34例人脑胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA的表达情况，研究结果与文献一致，即胶质瘤标本中存在MT1-MMP基因表达的上调，但机制未明，推测可能与抑癌基因的失活及甲基化有关，有待进一步研究。本研究还发现胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA 表达在病人性别、年龄和病理类型之间无统计学差异。因此，MT1-MMP基因mRNA 表达与病人性别、年龄和病理类型不存在相关性，只与病理级别相关。

　　实时荧光定量RT-PCR是近年发展起来的一种快速、准确且可重复性好的检测基因重复或缺失的新方法，即在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR特异性地掺入DNA双链小沟，发射绿色荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。因此，可以通过检测反应体系中的SYBR荧光强度来检测PCR产物的扩增量。在实时荧光定量PCR中，模板定量有两种方法：绝对定量和相对定量。相对定量的方法又分为：标准曲线法和比较Ct法。本实验采用后者，直接通过计算△△Ct得出结果，△△Ct的定义：目标A/目标B = 2-△△Ct，△Ct是一个常数，PCR效率相同，△Ct就恒定，而与加样多少无关，Ct表示循环阈值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数[7]。与检测MT1-MMP基因的其他方法比较，SYBR基因定量方法具有高度特异性和灵敏性，且成本低廉，自动化程度高，但由于SYBR和双链DNA 的结合是非特异性的，在PCR 反应过程中可能产生非特异产物、引物二聚体等均会形成类似的扩增曲线，因此，反应时要设定溶解曲线分析。为了使试验结果可信，减少系统误差，我们在确保试剂和机器稳定性的前提下，一般采取3种措施[8]：①设立内参监控系统DNA污染。②由于RNA提取过程中，DNA的污染在所难免，MT1-MMP引物设计PCR产物在100 bp左右，非常短，能减少DNA的非特异性扩增。③采用同一样品6管复管测试，取平均值，尽量减少操作中定量荧光的误差。

　　综上所述，本实验证实了胶质瘤中MT1-MMP基因mRNA的表达趋势及其与肿瘤恶性程度的关系。MT1-MMP和人脑胶质瘤的发生、发展、恶性程度密切相关，MT1-MMP在脑胶质瘤组织中的检测可作为判断其恶性程度的重要指标之一。当然，胶质瘤的发病是涉及多基因、多因素的复杂过程，MT1-MMP基因在其中所起的只是部分作用。同时由于检测方法亦有片面性和误差，故不能简单地认为MT1-MMP在胶质瘤发病中起主要作用，但可为胶质瘤的诊断和治疗提供一个新的思路。随着转基因技术和基因沉默技术等的发展，以MT1-MMP为靶点的手段可能会成为治疗胶质瘤的有效手段之一。

　　【参考文献】

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　　[2] SATO H, TAKINO T, OKADA Y, et al. A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumour cells [J]. Nature, 1994, 370(6484): 61-65.

　　[3] FORSYTH P A, WONG H, LAING T D, et al. Gelatinase-A (MMP-2), gelatinase-B (MMP-9) and membrane type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) are involved in different aspects of the pathophysiology of malignant gliomas [J]. Br J Cancer, 1999, 79(11-12): 1828-1835.

　　[4] NAKADA M, NAKAMURA H, IKEDA E, et al. Expression and tissue localization of membrane-type 1, 2, and 3 metalloproteinases in human astrocytic tumors [J]. Am J Pathol, 1999, 154(2): 417-428.

　　[5] 牛光明, 尹先印, 万锋, 等. 人脑胶质瘤组织中MT1-MMP、MMP-2 mRNA的表达 [J]. 郑州大学学报(医学版), 2004, 39(4): 597-599.

　　[6] 张海泉, 袁先厚, 江普查, 等. MT1-MMP及MMP-2在人脑胶质瘤中的表达及意义 [J]. 现代肿瘤医学, 2006, 14(2): 138- 141.

　　[7] 张鋆. 荧光实时定量PCR技术初探 [J]. 生命科学趋势, 2003, 1(4): 1-28.

　　[8] KE L D, CHEN Z, YUNG W K, et al. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards [J]. Mol Cell Probes, 2000, 14(2):127-135.