三种方法制作大鼠蛛网膜下腔出血模型

　　作者：高成　　作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】目的探讨三种方法制作大鼠蛛网膜下腔出血 (SAH) 模型的应用价值。 方法 分别采用颈内动脉穿刺法 (PIC)、枕大池2次注血法 (ACM) 和交叉前池注血法 (APC) 制作大鼠SAH模型。观察不同模型的病死率、蛛网膜下腔血液分布及含量、脑血管痉挛程度及持续时间、伴发脑水肿、血-脑屏障 (BBB) 通透性等方面的改变。 结果 三种方法均成功制作SAH模型。病死率：PIC为46.2%，ACM为25.0%，APC为11.1%。血管痉挛高峰时间：PIC与APC均为第2天，第3~5天恢复正常;ACM为第5天，持续7 d。蛛网膜下腔血液量：ACM为 (240.50 ± 25.38) μl，APC为 (172.15 ± 25.45) μl;PIC模型变异大，为60~520 μl，平均 (267.12 ± 45.86) μl。PIC模型脑水肿最重，ACM与APC模型脑水肿相对较轻。PIC模型造成严重的BBB通透性损害，另两组损害程度相近。 结论 三种方法制成的模型适用于研究SAH不同病理生理改变的需要。PIC脑水肿重，病死率高，适用于SAH后脑损害的机制研究;ACM脑血管痉挛的时间特征与人SAH后血管痉挛接近，适用于血管痉挛的机制研究;APC血液恒定分布于前循环，病死率低，适用于研究SAH后急性脑血管痉挛的发病机制。

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血 模型 动物 血管痉挛 颅内 脑损伤

　　Comparison of three subarachnoid hemorrhage models in rats

　　GAO Cheng, CHEN Huirong, LIU Xiangzhen, et al.

　　Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China

　　Abstract: Objective To explore the application value of three kinds of subarachnoid hemorrhage (SAH) model in rats. Methods SAH was induced in male Wistar rats by puncture of internal carotid artery (PIC), and autologous blood injection into cisterna magna (ACM) and prechiasmatic cistern respectively (APC). Mortality, blood volume and distribution of the subarachnoid space, severity and duration of cerebral vasospasm, severity of cerebral edema and blood brain barrier (BBB) permeability were recorded. Results The mortality of three groups was 46.2% in PIC group, 25.0% in ACM, and 11.1% in APC respectively. The most serious vasospasm occurred on day 2 in both PIC and APC group and recovered to normal status on day 3, while peak vasospasm in ACM group happened on day 5 and lasted for 7 days. Blood volume in the subarachnoid space was relatively steady in ACM (240.50±25.38 μl) and APC group (172.15±25.45 μl), which varied obviously in PIC group (60-520 μl, averaged 267.12±45.86 μl). Cerebral edema was the most serious in PIC group while relatively mild in APC group. ACM had a moderate cerebral edema compared with the other two groups. BBB permeability in PIC was the most severe compared with APC and ACM groups. Conclusion These three methods can be used to study the different physiopathological processes involved in SAH. PIC model is suitable for studying the mechanisms of brain damage developed after SAH. ACM model is eligible for studying the chronic vasospasm. APC can be used for research of acute cerebral vasospasm after SAH.

　　Key words: subarachnoid hemorrhage; models, animal; vasospasm, intracranial; brain injuries

　　目前，尚无一种动物模型能够完全模拟人类蛛网膜下腔出血 (SAH) 的病理生理过程[1]。本实验应用三种不同方法制作大鼠SAH模型，比较不同模型对研究SAH的价值。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 雄性Wistar大鼠 (n = 60，体质量280～340 g)，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，随机分为3组;另取10只大鼠作为正常对照，不予任何处理。Opton手术显微镜，戊巴比妥钠 (30 mg/ml)，血管直径自动测量系统 (Micro-optic Industrial Group Co.，Ltd)，分光光度计 (BioRad)，动物保温毯等。

　　1.2 模型制作 参照文献[2-4]简述如下：①颈内动脉穿刺法 (PIC，n = 26)：大鼠仰卧位，颈部剃毛，沿颈部中线逐层剪开皮肤、皮下组织，显露右颈总动脉分叉处。血管夹阻断颈外动脉，于血管夹近端剪开颈外动脉，插入3-0单股尼龙线进入颈内动脉，从颈总动脉分叉部开始，刺入18~20 mm后感觉阻力存在，继续插入约3 mm，刺破大脑中动脉和大脑前动脉分叉处，停留穿刺线15 s后撤出。②枕大池2次注血法 (ACM，n = 16)：大鼠头低位30°，后枕部正中切开并显露环枕筋膜，枕大池穿刺抽出脑脊液约0.3 ml。股动脉抽取自体未抗凝动脉血300 μl，以0.15 ml/min速度注入枕大池。注射结束后，生物蛋白胶封闭穿刺孔，保持头低位20 min，使血液均匀分布于基底池。首次注血后48 h，再次注血0.2 ml。③交叉前池注血法 (APC，n = 18)：大鼠俯卧位，额部正中开颅，牙科钻头颅骨钻孔，采用立体定向仪 (江湾Ⅱ型) 在前囟前7.5 mm，倾斜矢状面30°进针，10 mm左右达到颅底。股动脉抽取动脉血0.2 ml，自制带侧孔针头缓慢注射，注血时间2 min，注射结束后骨蜡封闭颅骨骨孔。

　　1.3 基底动脉血管截面积测量 制作模型后第2、3、5、7天，每组取3只大鼠，行左心室插管进入升主动脉，结扎降主动脉，首先灌注冰预冷PBS 150 ml清除血液。然后灌注4%多聚甲醛50 ml，断头，鼠脑以4%多聚甲醛固定24 h (灌注液经0.22 μm滤器过滤，灌注压力60~80 mmHg[5])。解剖分离大脑，切取基底动脉、大脑后动脉、大脑前动脉，行苏木精-伊红染色，采用自动测量系统测量血管周径，按照公式：S (面积) = 1/4 C (周长) 2/π计算。为排除血管变形造成的测量误差，每个标本至少测量3个部位后取平均值。

　　1.4 蛛网膜下腔血液含量测定 参照文献[3-4]方法，略有改动。模型制作90 min后，收集动脉血样。升主动脉灌注250 ml生理盐水，完全去除血管内血液。完整分离大脑，保持蛛网膜完整，脑组织于15 ml磷酸钾缓冲液内 (磷酸钾60 mmol/L，5% Triton-X 100， 100 U 肝素) 4 ℃保存。鼠脑以超声匀浆器破碎，4 ℃，3 500 rpm离心10 min，收集上清，重复3次。取上清于415 nm条件下测定吸光度，按血红蛋白稀释度计算上清内血液含量。

　　1.5 血-脑屏障 (blood brain barrier，BBB) 通透性

　　根据Uyama等[6]报告的方法，造模24 h评价BBB通透性。股静脉注射2% Evans蓝 (EB) 5 mg/kg，60 min后对脑组织中的外渗EB应用广谱荧光光度测定法行定量分析。先将EB按照1 × 10-1~1 × 10-5倍比稀释，620 nm条件下测定吸光度值，制作标准曲线。脑组织称重后超声匀浆破碎，4 ℃，2 000 rpm离心20 min，收集上清，重复3次。取上清测定620 nm条件下的吸光度值，标准曲线上读出EB含量，以μg/g脑组织表示。

　　1.6 脑水肿检测[7] 完整分离脑组织，保持蛛网膜完整，测量脑组织湿重;烤箱内120 ℃烘烤24 h后测干重。含水量= (湿重-干重)/湿重 × 100%。

　　1.7 统计学处理 各参数以x ± s表示，采用SPSS 11.0统计软件行单因素方差分析 (one-way ANVOA)，以P <0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 病死率 三组模型病死率分别为：PIC 46.2% (12只)，ACM 25.0% (4只)，APC 11.1% (2只);该结果与文献报告的病死率相似[2-4]。

　　2.2 脑血管痉挛发生时间和累及血管 PIC模型：前后循环血管均明显痉挛，这与穿刺所造成的血液弥散分布于基底池有关;但第2天检查发现：血液大部分吸收，第3天开始血管痉挛明显缓解，第5天完全消失。APC模型：血管痉挛主要累及大脑前动脉，基底动脉血管痉挛不明显，这与血液主要分布于前循环有关;第2天血管痉挛最明显，第5天基本恢复正常。ACM模型：血管痉挛主要累及后循环，以基底动脉和大脑后动脉最重，大脑前动脉血管痉挛与PIC模型比较相对较轻;血管痉挛在第2次注血后48 h最明显，第7天时仍明显痉挛，这与人类SAH后血管痉挛时间特征接近 (表1)。

　　2.3 基底池血液分布及含量 PIC模型颅内血液分布弥散，遍布蛛网膜下腔，血液含量 60~520 μl，平均(267.12 ± 45.86) μl，变异较大。APC模型血液主要分布于前循环，血液含量恒定，为 (172.15 ± 25.45) μl。ACM模型血液主要分布于后循环，部分大鼠血液弥散于整个蛛网膜下腔，血液含量介于上述两种模型之间，为 (240.50 ± 25.38) μl。

　　2.4 BBB通透性改变 PIC模型造成明显BBB通透性损害，外渗的EB平均为 (1.60 ± 0.23) μg/g脑组织;APC模型BBB通透性损害最轻，外渗EB为 (0.45 ± 0.14) μg/g脑组织;ACM组4只 (25%) 大鼠发生了比较显著BBB通透性损害，其外渗EB平均为 (1.31 ± 0.35) μg/g脑组织，另8只大鼠BBB损害不明显。

　　2.5 脑水肿 正常大鼠脑组织水分含量约 (75.12 ± 3.85)%。PIC模型造成明显脑水肿，水分含量为 (86.12 ± 6.78)%;APC模型脑水肿较轻，水分含量为 (78.25 ± 3.25)%;ACM模型脑水肿程度介于上述两者之间，水分含量为 (81.25 ± 3.56)%。

　　3 讨 论

　　SAH所造成的多种变化，如脑损害、血管痉挛、颅内压改变等一系列病理生理和分子机制尚未阐明，理想的动物模型可为SAH不同机制的研究提供有力的帮助。

　　目前采用的大鼠SAH模型大致可分为三类[1]：①血管内穿刺法，通过穿刺将颅内动脉刺破造成SAH。可以通过颈内动脉、颈总动脉或颈外动脉插入穿刺导线，也可通过立体定向方法穿刺颅内血管，穿刺部位多为大脑中动脉与大脑前动脉分支处，也有穿刺基底动脉的报告。该方法的优点是颅腔闭合，比较符合人类动脉瘤性SAH的病理生理过程;缺点是不容易控制SAH的严重程度，蛛网膜下腔内血液含量变异较大，动物病死率高。②在一定的压力下 (一般在平均动脉压水平)，将血液注射到蛛网膜下腔。此方法的优点是注射血液过程中平均动脉压水平保持恒定不变，不影响模型脑血流量;缺点是操作比较复杂，所需要的仪器设备要求较高。③事先准备适量的自体血液，注射到蛛网膜下腔 (通常注射到枕大池或交叉前池)。这种方法的优点是能够比较精确地控制蛛网膜下腔血液量，制成的SAH模型严重程度相近;缺点是需要开放颅腔，引起颅内压的变化，与人类SAH颅腔闭合的特点相悖。

　　本研究采用的方法分属于第1类和第3类。APC模型病死率最低，所造成的脑损害较轻;而PIC模型病死率高达46.2%，说明该方法造成的脑损害较重;采用ACM制作模型时，第1次注血后大鼠无死亡，对大鼠的影响较小;重复注血后病死率为25.0%，低于PIC法。PIC模型蛛网膜下腔出血量变化较大，脑水肿严重，BBB破坏明显，同时颅底各血管均发生明显血管痉挛;该法制作的模型比较接近于临床上重型SAH病人 (Hunt-Hess分级Ⅳ～Ⅴ级)，因此适合研究SAH后脑损害、血管痉挛等的发病机制。APC模型血液含量变异较小，血液比较恒定地分布于前循环，脑损害较轻，脑水肿不明显，血管痉挛主要发生于大脑前动脉，类似于临床常见的前循环动脉瘤的病理过程，因此适合研究前循环动脉瘤造成SAH的病理生理机制，以及脑血管痉挛的发病机制。ACM法操作比较复杂，需要2次手术;血液主要分布于后循环，脑水肿的严重程度介于PIC和APC之间，血管痉挛以基底动脉为主，BBB在一部分动物发生了比较明显的损害，大部分动物BBB通透性改变不明显;其特点是脑血管痉挛的时间特征与人类的脑血管痉挛比较接近[2]，造模后第7天仍然非常明显，因此，适合研究血管痉挛慢性阶段的各种机制。

　　【参考文献】

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