骨髓间充质干细胞在脑损伤中的治疗前景

　　作者：张国哲　　作者单位：天津市环湖医院神经外科，天津 300060

　　【关键词】 骨髓间充质干细胞;中枢神经系统;细胞移植

　　长期以来中枢神经系统(CNS)的损伤与再生一直是困扰人类健康的难题，也是科学家们研究的焦点。曾经认为人脑内的神经细胞缺乏再生能力，如果遇到损伤，受损的神经细胞将会永远丧失，由胶质细胞充填。19世纪末至20世纪初，人们逐渐发现低等脊椎动物和两栖类的中枢和外周神经损伤后都能再生，而在哺乳动物中，断定只有外周神经系统(PNS)损伤后可以再生，CNS则没有再生能力。然而随着近十余年对神经干细胞研究的逐步深入，这一传统认识现已被彻底打破。以往对于神经系统疾病的移植治疗，主要用胚胎神经干细胞治疗Parkinson病、缺血性疾病[1]、颅脑外伤[2]等，其不足包括组织来源缺乏、伦理学问题及免疫排斥等多方面问题。为避开胚胎来源NSCs的局限性，近年成人骨髓间质干细胞向神经细胞的分化及在神经修复中的作用，因其独有的优势，已成为NSCs的研究热点。

　　1.神经干细胞的概念及生物学特性

　　神经干细胞(Nerual stem cells，NSCs)的发现是在研究造血发生和神经发育的基础上开始的，于20世纪90年代初，Reynolds[3]从成年小鼠脑纹状体分离出能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群，参照造血系统干细胞的性质，正式提出了NSCs的概念，它是一类多能干细胞，能长期自我更新(复制)，并具有分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的多潜能特性。Gage[4]指出，神经干细胞通常具有:来源于神经系统能产生神经组织;有自我更新能力;能通过不对称细胞分裂产生除自我子代(仍为干细胞)以外的其他类型的细胞(前体细胞)。通过大量试验研究，目前NSCs的生物学特性可概括为:①能产生神经组织或起源于神经系统;②有增殖能力;③在整个生命过程中能自我维持、自我更新;④能通过扩增祖细胞而产生大量的后代;⑤具有向多细胞系分化的能力;⑥损伤或疾病能刺激干细胞分化。维持干细胞的数量有两个分裂途径：①对称性分裂，即干细胞分裂后产生的两个子细胞均还是干细胞;②不对称性分裂，即干细胞分裂后的两个子细胞一个为干细胞，而另一个为祖细胞，祖细胞在外界刺激因子的作用下可向多个细胞系的终末期分化。可以认为神经干细胞不仅能促进神经元的再生及脑组织的修复，而且通过基因操作，神经干细胞可以作为载体用于神经系统疾病的基因治疗，如表达外源性的神经递质、神经营养因子及代谢性酶[1，5，6]。

　　2.间充质干细胞的来源及研究意义

　　130年前，德国病理学家Cohnheim在研究伤口修复时，就提出骨髓中可能存在非造血组织的干细胞。直到20世纪70年代中期，Friedenstein等才首次报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落[7]。后来的研究表明Friedenstein粗糙分离所得到的细胞是多能的，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。因此，骨髓基质中的这种多能细胞，由于能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，而被称为间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSCs)。1998年Azizi等[8]将人类的骨髓基质细胞植入鼠的纹状体，发现大约20%的植入细胞发生迁移。移植细胞的迁移路径与已知的神经干细胞及星形胶质细胞的迁移路径相同，未发现炎症和免疫反应。2000年Brazelton[9]和Mezey[10]两个研究小组分别通过不同的方法观察到体内条件下,外源的MSCs 在小鼠脑内可转变为神经元, 取得了骨髓来源的间充质干细胞分化为神经细胞的重大突破,这提示可以利用MSCs 治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的可能性。人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)能够分化为神经元样和神经胶质样细胞，其取材容易，体外可迅速培养、扩增，弥补了神经干细胞的诸多缺点，自体BMSCs移植又避免了移植后的免疫排斥反应，因此BMSCs作为神经细胞的另一来源，用于神经系统损伤修复的细胞治疗和基因治疗的载体，具有明显的临床应用价值。

　　3.骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

　　Friedenstein首先通过贴壁培养的方法分离得到BMSCs，他们将全骨髓组织用塑料培养皿培养4h后弃未贴壁细胞，贴壁细胞外观呈多样性，经过2～4天的休眠期后迅速增殖，培养数代后形态趋于一致，呈纺锤形。新鲜骨髓内，造血干细胞所占比例较大，造血干细胞较难培养扩增，往往不贴壁生长，而间充质干细胞则易于分离扩增并贴壁生长。原代培养2～3周后，大多数造血干细胞死亡，剩下的即为BMSCs。BMSCs在原代培养以低密度种植可形成单细胞克隆，并增殖迅速。高密度种植生长缓慢，其原因与细胞间相互接触抑制或细胞分泌的因子作用有关[11]。目前，从体内分离BMSCs的方法主要有密度梯度结合贴壁生长的方法;纤维微珠的方法，但是分离培养后具有骨组织分化倾向;还有人采用免疫凋落的方法分离BMSCs[11，12]。MSCs在体外培养时，保持干细胞的特性自身不断地增殖，在不同诱导条件下能够向不同谱系分化。已有许多实验室在体外条件下利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、维甲酸(RA)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、甲状腺素3(T3 )、胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)等作为增殖及分化诱导因子[11]。袁维等用β巯基乙醇(βME)和硫代甘油、叔丁基对羟基茴香醚(BHA) 、二甲基亚砜(DMSO) 3 种方法对BMSCs进行诱导分化，均能使BMSCs分化为神经元样细胞[13]。通过免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定，结果证实BMSCs在一定的培养条件下可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。王明元等[14]通过体外实验发现，神经前体细胞(NPC)能在BMSCs分泌的培养上清液中基质细胞衍生因子1α(SDF1α)的作用下发生定向迁移，特异性抗CXCR4单抗能有效阻断NPC的定向迁移效应，证实了BMSCs分泌的SDF1α促进表达CXCR4的NPC向病灶处迁移，可能是促进神经功能修复的机制之一, 从而为BMSCs移植治疗神经功能缺损提供了理论基础。骨髓间质来源的BMSCs，形态成纤维样，可聚集成均匀的集落，流式细胞术分析表明分离的细胞群体表型单一。体外由BMSCs分化成的神经细胞很少表现出典型的成熟神经元或神经胶质细胞的形态，而应用免疫细胞化学技术可更准确、方便地鉴定各类培养细胞。常用于鉴定星形胶质细胞的标志物是胶质纤维酸性蛋白(GFAP);鉴定少突胶质细胞的标志物有半乳糖苷酶(GalC)和碳酸苷酶Ⅱ(CAⅡ)[12]。

　　4.骨髓间充质干细胞对中枢神经的保护作用

　　骨髓间充质干细胞移植具有自我更新和多向分化增殖潜能，已有研究表明，骨髓细胞是某些脑细胞如小胶质神经细胞和星形胶质细胞的前体细胞。Chopp等[15]多次将BMSCs应用于脑外伤或脑缺血动物模型，发现BMSCs约1%分化为神经元，5%～8%分化为神经胶质细胞，并明显促进神经功能恢复。Chen[16] 将BMSCs和脑源性神经生长因子(BDNF)共同植入大鼠缺血模型的脑缺血边缘，在包括运动、感觉、反射和旋转的神经功能评分中，接受移植的大鼠功能明显改善。Zhang[17]将BMSCs经颈动脉、颈静脉及侧脑室途径植入大鼠脑出血模型，发现BMSCs迁移至海马区及同侧皮层，并分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，颈动脉组和侧脑室组的运动功能明显改善。Iihoshi[18]将BMSCs静脉注射于成鼠大脑中动脉闭塞模型，发现BMSCs积聚到梗塞区域周围，并分化为神经元和神经胶质细胞，神经功能较对照组明显改善。BMSCs移植到脑组织中，在局部存活的数量有限，且大部分分化为神经胶质细胞。BDNF在神经细胞发育、存活及损伤修复中起关键作用，对BMSCs在体外向神经细胞分化具有明显的促进作用[13]。通过基因载体将连接了启动子的BDNF基因导入BMSCs，BMSCs自身便可持续稳定地表达BDNF。Zhao[19]经体外实验证实BDNF转导的BMSCs(BDNFBMSCs)细胞存活率及神经元分化率均较用RA和BDNF诱导组明显提高。Kurozumi[20]将BDNF转染的BMSCs应用于成鼠大脑中动脉闭塞模型，于7天、14天进行MRI及神经功能评定均较对照组明显改善。Nomura[21]分别将BMSCs和BDNF转染的BMSCs于闭塞后6小时静脉注射于成鼠大脑中动脉闭塞模型，于闭塞后6小时、1天、3天、7天应用MRI测量脑梗死大小并进行神经功能评定，发现两组的梗死面积及神经功能均较对照组明显改善，BDNFBMSCs组效果更明显。越来越多的研究人员认为植入的BMSCs分化为神经元，仅产生一部分治疗效果，而移植治疗最主要的疗效来自于种子细胞产生的多种生长因子所起到的神经保护和促进血管生成作用。BDNFBMSCs分泌的神经营养因子，可营养支持病变局部及其周围的神经细胞，减少凋亡，促进修复。

　　5.骨髓间充质干细胞在脑损伤中的应用前景

　　骨髓间充质干细胞于临床前的动物实验结果表明，BMSCs移植无论是局部或静脉途径都能产生积极的治疗作用。近年来，人们不断地探索利用hBMSCs进行细胞治疗和基因治疗。只需通过局部麻醉，就可较容易地得到少量骨髓抽取物，而不影响人体的健康;而且将分离的hBMSCs在体外培养扩增也相对方便，通过自体移植亦可避开免疫排斥反应，且能以多种途径包括静脉注射、脑内不同部位注射进行细胞移植。另外，可以将BDNF基因转导入hBMSCs，促进定向分化，并起到神经保护和促进血管生成作用，加快体内神经组织修复的进程。所以骨髓间充质干细胞在脑损伤修复中的临床应用前景广阔。但我们也应该清楚的认识到,有关BMSCs的研究还处于起步阶段，仍有许多悬而未决的问题,在BMSCs安全有效地用于临床之前，显然需要解决大量有关的BMSCs的基础问题，比如组织相容性、优化定向分化，BMSCs的临床应用还会有很长的路要走。

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