MDR1启动子调控的双自杀基因靶向杀伤耐药胶质瘤细胞的研究

　　作者：王波,王志云,王成伟,王志刚,张源,张庆　　作者单位：山东大学第二医院神经外科， 济南 250033; 潍坊市人民医院， 山东 潍坊 261041

　　【摘要】目的 探讨多药耐药基因(MDR1)启动子调控的CD、TK双自杀基因系统并加前体药物丙氧鸟苷及5氟胞嘧啶(pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5FC)对耐药胶质瘤细胞(C6/ADR细胞)的靶向杀伤作用。方法 利用脂质体介导法将含有MDR1启动子调控的CD、TK双自杀基因的真核表达载体PcDNA3.MDR1P.CD.TK转染入C6/ADR细胞(C6/ADR/CDTK)，利用PCR鉴定CD、TK基因的整合，利用RTPCR鉴定CD、TK基因的表达;然后以转染了质粒pcDNA3.MDR1P.CDTK的C6细胞(C6/CDTK)和正常C6/ADR细胞作为对照，分别加前体药物，利用生长曲线、流式细胞仪、平板克隆形成等方法研究双自杀基因对耐药胶质瘤细胞生长、细胞周期及增殖的影响。结果 PCR结果显示，CD、TK基因均整合入C6和C6/ADR细胞中;RTPCR结果显示，C6/ADR/CDTK细胞中CD、TK基因有特异性表达，而C6/CDTK细胞无特异性表达。应用前体药物后，C6/ADR/CDTK细胞增殖明显受抑;C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞经流式细胞仪检测G1期的细胞比例分别为32.68%、47.57%、99.93%(P<0.05，其平板克隆形成率分别为(96.7±2.1)%、(86.7±1.9)%、(16.7±0.9)%(P<0.05)。结论 pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5FC系统对C6/ADR具有较强的靶向杀伤作用.

　　【关键词】 多药耐药基因;启动子;转染;胶质瘤;基因治疗

　　Targeted killing effects of double suicide genes controlled by　the MDR1 promoter on C6/ADR cells

　　WANG Bo, WANG Zhiyun, WANG Chengwei, WANG Zhigang,　ZHANG Yuan, ZHANG Qinglin

　　1. Department of Neurosurgery, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China;

　　2. Weifang People′s Hospital, Weifang 261041, Shandong, China

　　Abstract: Objective To investigate the targeted killing effects of a double suicide gene system controlled by the MDR1 promoter with the prodrug GCV+5FC on C6/ADR cells. Methods The recombinant vector pcDNA3.MDR1P.CD.TK containing CD and TK double suicide genes controlled by the MDR1 promoter was transfected into C6/ADR cells by using liposome. PCR and RTPCR were used to identify the integration and expressions of the CD and TK genes. This recombinant vectortransfected C6 cells (C6/CDTK) and normal C6/ADR cells were set as controls. After adding the prodrug, the effects of double suicide genes on cell growth, cell cycle and proliferation were determined by cell growth curve, flow cytometry (FCM) and plate colony formation assay. Results PCR proved double suicide genes were integrated into C6/ADR and C6 cells. RTPCR revealed that the CD and TK genes were expressed in C6/ADR/CDTK cells C6/ADR/CDTK cells was inhibited. G1 phase proportion was significantly higher in C6/ADR/CDTK cells (99.93%) than in C6/ADR cells and C6/CDTK cells (32.68% and 47.57%, P<0.05); the formation rate was significantly lower in C6/ADR/CDTK cells [(16.7±0.9)%] than in C6/ADR cells and C6/CDTK cells [(96.7±2.1)% and (86.7±1.9)%, P<0.05]. Conclusion The pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5FC system has targeted killing effects in C6/ADR cells.

　　Key words: Multidrug resistance gene; Promoter; Transfection; Glioma; Gene therapy

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、质粒、脂质体

　　胶质瘤细胞敏感株C6和耐药株C6/ADR[1]由山东大学齐鲁医院血研室保存。质粒pcDNA3.MDR1P.CD.TK为本课题组构建[2]，是将pcDNA3的CMV启动子替换成MDR1的启动子、多克隆位点插入CD和TK双自杀基因制备而成，其结构。脂质体(Lipofectamine TM2000)购自GIBCO BRL公司。

　　Structure of recombinant vector pcDNA3.MDR1P.CD.TK

　　1.2 PCR引物的设计合成

　　PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。检测CD、TK基因所用的引物序列为：CD基因上游引物(P1)：5′TGG ATG CCG AAC AAG GTT TAG3’，下游引物(P2)：5′GTA TCG AAA CGT CCT TGC AGA TG3′;TK基因上游引物(P1)：5′CAG CAA GAA GCC ACG GAA GT3′，下游引物(P2)：5′CTG CAG ATA CCG CAC CGT AT3′。

　　1.3 细胞培养

　　复苏C6/ADR细胞后，用含10%新生牛血清(neonatal bovine serum, NBS)或胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养液，在37?℃、5% CO2孵箱中培养。

　　1.4 质粒转染与鉴定

　　取对数生长期的C6及C6/ADR细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，接种至24孔板中。按照Lipofectamine TM2000说明书进行转染，培养6～24?h后，细胞1：8传代，换用500?μg/mL G418的RPMI1640培养基继续培养。大部分细胞死亡脱落，只有少数细胞存活;继续用500?μg/mL G418加压培养，超过一个月后，换用含G418 200?μg/mL的培养基传代培养，以转染pcDNA3.MDR1P.CDTK表达载体的C6/ADR细胞为C6/ADR/CDTK 细胞，以转染pcDNA3.MDR1P.CDTK表达载体的C6细胞为C6/CDTK细胞及未转染的C6/ADR细胞作为对照。利用碱变性法提取转染细胞C6/CDTK、C6/ADR/CDTK基因组DNA，以其为模板，利用CD、TK引物，进行PCR扩增，扩增片段长度分别为727?bp、651?bp，反应条件为：94?℃预变性5?min;94?℃ 1?min，55?℃ 1?min，72?℃ 2?min，30个循环;72?℃延伸10?min。取15?μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。利用RNA抽取试剂盒分别提取C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞总RNA，以Oligao( dT)18非特异性引物进行逆转录成cDNA后，再以逆转录产物为模板，利用CD、TK引物进行CD、TK基因的PCR扩增，扩增条件同上，电泳后观察结果并拍照。

　　1.5 MTT法测定细胞增殖

　　取对数生长期的C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞，胰酶消化、离心后，分别接种于96孔板中，使细胞浓度为2×104/孔(200?μL)，37?℃、5% CO2培养箱培养过夜。次日，每孔加入不同浓度的GCV+5FC贮存液，37?℃、5% CO2培养箱孵育3?d。弃去含药培养液，每孔加入180?μL新鲜无药培养液及20?μL (5?mg/mL)的MTT贮存液，于37?℃、5% CO2培养箱孵4?h。终止培养，弃去上清，每孔加入150?μL DMSO，振荡10?min，使结晶物充分溶解，用Microplate Imaging System(Ultramark，BioRad)测各孔的OD值，以540?nm为测量波长，630?nm为参考波长。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞周期

　　将对数生长期上述三组细胞消化后，分别按1.0×105/mL的浓度接种于培养瓶中，常规培养24?h待细胞贴壁后，更换含有GCV 60?μg/mL和5FC 600?μg/mL的培养液。37?℃、5% CO2培养箱培养3 d后，收集细胞，以70%乙醇固定，PBS离心沉淀，去除固定液，细胞漂洗后以100目筛网过滤，1?500?r/min，离心5?min，每组收集5×106细胞，制成细胞悬液，与等体积MI(含甘露醇、磷酸二氢钠、MgCl2和NaCl)混和，室温染色20?min，过300目尼龙膜除去杂质，选用488?nm激发波长测定。

　　1.7 平板克隆形成实验检测克隆形成率

　　取对数生长期的上述三组细胞，经胰酶消化成单细胞悬液，计数后以每孔100个细胞接种于12孔板，培养过夜后加用GCV、5FC，连续培养14?d，甲醇固定，Gimsa染色，计数孔内细胞克隆数，按以下公式计算克隆形成率：细胞克隆形成率=细胞克隆数/接种数×100%。

　　1.8 统计学处理

　　实验数据用±s表示，统计学分析采用SPSS11.5统计软件包进行，统计学方法采用方差分析和χ2检验， P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PCR鉴定基因整合情况

　　C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞CD、TK基因PCR产物分别在727?bp、651?bp处可见阳性条带，而C6/ADR细胞CD、TK基因表现为阴性，证明CD、TK基因已整合到细胞的基因组上。

　　2.2 RTPCR鉴定基因表达情况

　　C6/ADR/CDTK细胞CD、TK基因分别在727?bp、651?bp处有阳性条带，而C6/CDTK细胞表现为阴性，说明由于MDR1启动子的原因，CD、TK基因在多药耐药细胞株C6/ADR中得到了表达。

　　2.3 MTT法测定细胞增殖结果

　　C6/ADR/CDTK细胞应用前体药物后，细胞增殖较C6/CDTK细胞、C6/ADR细胞明显受抑且有明显的剂量依赖关系。C6/CDTK细胞应用前体药物后，细胞增殖受抑情况比C6/ADR细胞稍明显一些，表明除前体药物的毒性作用外，自杀基因也发挥一定作用。

　　2.4 流式细胞术检测细胞周期

　　C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞的G1期含量分别为32.68%、47.57%、99.93%，各组细胞S期的含量分别为64.51%、49.24%、0.07%，C6/ADR/CDTK细胞的G1期百分比含量明显低于两个对照组;而细胞的S期百分比含量与此相反(P<0.05)。以上结果表明，C6/ADR/CDTK细胞从G1期向S期的进程受到显著抑制。

　　2.5 细胞克隆形成率检测结果

　　C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK三组细胞加用GCV和5FC后，培养2周后可见细胞集落形成，Gimsa染色，计算克隆形成率分别为(96.7±2.1)%、(86.7±1.9)%、(16.7±0.9)% 。C6/ADR/CDTK组克隆形成率明显低于两个对照组的的克隆形成率(P<0.05)。提示应用前体药物后C6/ADR/CDTK细胞的增殖能力显著下降。

　　3 讨 论

　　胶质瘤是严重威胁人类健康的一种恶性疾患，其多药耐药性已成为提高胶质瘤化疗疗效、延长患者生存的主要障碍。在肿瘤的基因治疗中，自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗中较为有效并有临床应用前景的方法。自杀基因治疗的原理是通过基因转移系统将自杀基因转移至靶细胞内，借助自杀基因表达的酶使无毒的药物前体(prodrug)转变成毒性产物，最终导致靶细胞的杀伤效应。其靶向性是研究的热点，已有研究将自杀基因的表达受控于各种肿瘤特异性启动子，从而实现了自杀基因治疗的靶向性[34]。

　　人类MDR1基因定位于第七号染色体q21.1，cDNA全长4669?bp，编码170?kD的P糖蛋白(Pglycoprotein，Pgp)。MDR1基因的异常激活可导致Pgp 表达增加。Pgp是一种依赖于ATP的跨膜药物泵，能将细胞内的化疗药物泵出细胞外，导致细胞内有效药物浓度下降，从而避免或减轻了化疗损伤，产生耐药性[5]。Pgp的过度表达与多药耐药基因(mdr1)启动子活性异常有关。最近的研究表明，mdr1基因启动子受复杂的因素调节，而且有组织特异性，其功能上调可导致mdr1基因的过表达[6]。已有报道p53基因的突变可激活mdr1基因启动子，而通过导入野生型p53基因及甲基化封闭mdr1基因启动子则可使mdr1基因表达下降[7，8]。目前已经有研究利用mdr1基因启动子的特性进行特异性基因治疗[9]。

　　本研究利用多药耐药胶质瘤细胞中mdr1基因启动子的异常激活特性以实现对耐药细胞的靶向性基因治疗。C6/ADR耐药细胞系是由C6细胞经过长期的阿霉素诱导和筛选而建立起来的典型的耐药细胞系，MDR1 mRNA及Pgp高表达。本实验将已构建好的PcDNA3.MDR1P.CDTK真核细胞表达载体分别转染耐药的胶质瘤细胞C6/ADR和不耐药的细胞C6后,加用不同浓度的前药GCV和/或5FC观察其杀伤效果。实验结果证实，转染后用前药与不转染药比较有明显不同，说明自杀基因发挥了作用。转染pcDNA3.MDR1P.CDTK的耐药细胞C6/ADR较C6细胞对前药的敏感性更为明显，说明MDR1启动子具有一定的靶向选择性。随着药物浓度的升高，抑制作用随之升高，说明前药对细胞有剂量依赖性抑制作用。未转染质粒的细胞生长受影响较小，但是应用高浓度的GCV和5FC后，其生长也受到一定的影响，提示可能对正常组织细胞同样有影响，因此不能盲目追求前体药物的大剂量疗法。今后的研究方向将是选择更有效的靶向载体以实现最佳的选择性杀伤，并不断探索最佳用药剂量和用药途径。

　　本研究应用构建成功的PcDNA3.MDR1P.CDTK真核细胞表达载体转染耐药和非耐药胶质瘤细胞，并加前药GCV+5FC进行杀伤。结果证明，PcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5FC系统对耐药细胞C6/ADR的杀伤作用较非耐药C6细胞更为明显，具有一定的靶向选择性。本研究为解决胶质瘤等恶性疾病多药耐药问题提供了一条新的思路和方法。

　　【参考文献】

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　　[4]Pastorakova A, Hlubinova K, Altaner C. Treatment of human tumor cells by combine gene therapy harnessing plasmids expressing human tumor necrosis factor alpha and bacterial cytosine deaminase suicide gene[J]. Neoplasma, 2006, 53(6): 478484.

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　　[7]Johnson R A, Shepard E M, Scotto K W. Differential regulation of MDR1 transcription by the p53 family members: Role of the DNA binding domain [J]. J Biol Chem, 2005, 280(14):1321313219.

　　[8]Zhan M, Yu D, Liu J, et al. Transcriptional repression of protein kinase calpha via Sp1 by wild type p53 is involved in inhibition of multidrug resistance 1 Pglycoprotein phosphorylation[J]. J Biol Chem, 2005, 280(6):48254833.

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