p57kip2和p27kip1蛋白表达与脑胶质 瘤相关性

　　作者：李峰　　作者单位：110012 辽宁省沈阳市急救中心创伤外科

　　【摘要】目的 探讨在50例胶质瘤中57kip、27kip1二者与胶质瘤发生发展的关系以及二者之间相关性。方法 应用免疫组织化学技术检测50 例不同病理分级脑胶质瘤中p57kip2和p27kip1蛋白表达,10正常脑组织为正常对照。结果 p57kip2 、p27kip1在胶质瘤蛋白阳性表达率分别为34%(17/50)、 38%(19/50)，均低于正常脑组织70%(7/10)、 80%(8/10)。在胶质瘤Ⅰ～Ⅳ级的蛋白阳性表达率,差异均具有显著性意义。结论 p57kip2、P27kip1 在胶质瘤的发生、发展过程中起重要的作用，其表达水平与胶质瘤的分化程度密切相关，联合检测p57kip2、P27kip1是判断胶质瘤恶性程度的重要参考指标

　　【关键词】 胶质瘤 p57kip2 p27kip1 免疫组化

　　Expressions and their Relationship of p57kip2, p27kip1in Gliomas Li Feng Chen2 Yang2 in the Liaoning province the first aid center wound surgery, 110012，China

　　Abstract Objective To detected the expression of p57kip2 protein and p27kip1 protein by immunohistochemistry method in 50 glioma specimens during operation to investigate their roles in the carcinogenesis and progression of glioma, the relationship between these two genes.Methods Expressions of p16、p53 protein were detected by using S-P immunohistochemical technique in 50ases of brain glioma with different pathological types and 8 cases of normal brain tissue. Results The positive expression rate of p57kip2and　P27kip1 in glioma was34%(17/50)、 38%(19/50)respectively. They were all lower than nomal brain tissue 70%(7/10)、80%(8/10)。Among four groups of glioma, significant difference was identified between the four groups(P<0.05).A significant positive correlation ( r=0.456,P< 01)was observed between the eressions and the relationship of57kip2, p27kip1in Gliomas . Conclusion The significances of p57kip2,p27kip1 is important in the growth and development of glioma cells , and their expression is correlated with the pathological glioma grade。Combined detection of p57kip2、p27kip1 protein is helpful to judge the pathological grade of glioma cells.

　　Key words Glioma;p57kip2;p27kip1;Immunohistochemistry

　　细胞周期调控机制的破坏，导致细胞的失控生长。细胞周期调控机制决定着细胞是否、何时开始生长、分裂或死亡。这个精密的程序在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。如果在胚胎细胞中，细胞周期不能运行，结果是死亡;而一旦在成熟细胞，细胞周期不能运行，则结果是肿瘤发生。目前有关p57kip2, p27kip1在肿瘤增殖调控中作用的研究才刚刚起步，对于p57kip2, p27kip1在脑胶质瘤中的表达机制以及与胶质瘤细胞增殖活性的关系，尚未完全阐明，探讨p57kip2和p27kip1在胶质瘤中的表达情况及其与胶质瘤细胞增殖活性的关系，旨在进一步研究p57kip2和p27kip1在脑胶质瘤发生、发展及肿瘤增殖调控中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 组织标本 收集胶质瘤病理石蜡标本50例。男患者28例，女患者22例，年龄19～74岁之间，平均46.14岁。根据2000年修改的WHO神经系统肿瘤分类标准，对所有胶质瘤进行组织学分类和分级后，划分为低度恶性(I、II级)和高度恶性(III 、Ⅳ级)两种。低度恶性I级12例、II级15例，高度恶性III级13例、Ⅳ级10例。所有患者术前均未接受过放疗及化疗。对照组10例脑组织，其中正常脑组织无胶质细胞增生，无细胞坏死和水肿。各组在年龄、性别无统计学差异。

　　1.2 试剂 鼠抗人p57kip2单克隆抗体，鼠抗人p27kip1单克隆抗体，s-p免疫组化染色试剂盒,DAB显色试剂盒均购于福建迈新生物技术开发有限公司。3%H2O2、0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA),二甲基联苯胺(DAB)及苏木素。

　　1.3 方法 主要步骤 连续切片厚4μm ,脱蜡后经1%H2O2 10 min , 以阻断内源性过氧化物酶。0.01MpH 6.0 枸橼酸缓冲液,微波处理。10%小牛血清封闭, 切片中分别加入p57kip2, p27kip1抗体, 4 ℃过夜。加入二抗1∶250 及SP/ HRP , 1∶200 。DAB显色，苏木素衬染，树胶封片。脑组织为正常对照, 以PBS 代替一抗作为阴性对照。

　　1.4 统计学分析 运用SPSS11.5统计软件进行分析，应用x2检验和校正x2检验，Spersman等级相关分析。

　　2 结果

　　2.1 p57kip2在脑胶质瘤中的表达情况 在50例脑胶质瘤患者中，p57kip2蛋白阳性率为34% (17/50)，阳性反应细胞为细胞核和(或)胞浆内呈黄色或棕黄色的染色颗粒(表1)。 10例正常脑组织中(见表1)，p57kiP2蛋白阳性率为70% ( 7/10 )，两者比较差异有显著性(P<0.05)。脑胶质瘤中高度恶性组(Ⅲ～Ⅳ) p57kip2蛋白阳性表达率低于低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ)，二者差异有显著性(P<0. 05)。

　　2.2 p27kip1蛋白在脑胶质瘤中的表达情况 在50例脑胶质瘤患者中，p27kip1蛋白阳性率为38% (19/50 )，阳性反应细胞为细胞核和(或)胞浆内呈黄色或棕黄色的染色颗粒(表2)。10例正常脑组织中(见表2)，p27kiP1蛋白阳性率为70% ( 7/10 )，两者比较差异有显著性(P<0.05)。脑胶质瘤中高度恶性组(Ⅲ～Ⅳ) p27kip1蛋白阳性表达率低于低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ)，二者差异有显著性(P<0.05)。

　　p57kip2蛋白在脑胶质瘤中的表达情况

　　①p57kip2蛋白的表达ⅹ2= 10.74 ， P<0.05。②p57kip2蛋白在低度恶性组 (Ⅰ～Ⅱ)与高度恶性组 (Ⅲ～Ⅳ)的表达ⅹ2=3.91，P<0.05。

　　p27kip1蛋白在脑胶质瘤中的表达情况

　　① p27kip1蛋白的表达ⅹ2= 11.76 ，P<0.05。②p27kip1蛋白在低度恶性组 (Ⅰ～Ⅱ)与高度恶性组 (Ⅲ～Ⅳ)的表达ⅹ2=3.59, P<0.05。

　　2.3 p57kip2蛋白与p27kip1蛋白表达的关系 胶质瘤组织中p57kip2蛋白表达与p27kip1蛋白表达情况。400倍显微镜下每张载玻片计数500个细胞.依据染色阳性细胞所占细胞总数的百分率判定表达的阳阴性。阳性细胞>10%为阳性(+-+++)其中10%～25%为(+)26%～50%为(++)>50%为(+++)。无阳性细胞或阳性细胞<10%为阴性(-)。经Spersman等级相关分析两者在脑胶质瘤组织中呈明显正关(P<0.05，rs =0.456)。

　　P57kip2蛋白与p27kip1蛋白表达的关系

　　3 讨论

　　近年的研究表明，细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关，有人认为肿瘤可能是细胞周期疾病 。细胞周期G1期的调控是由多种细胞周期调控因子参与的复杂过程，而且G1期调控异常与肿瘤的发生发展关系密切。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase , CDKs)是细胞周期调控的的核心装置，调节多种关键底物的磷酸化，激发G1-S期、G2-M期转换。CDKs的抑制蛋白因子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKIs)是CDKs的负性调控因子，使CDKs失去活性。人p57kip2定位于染色体11p11.5，编码的蛋白P57kiP2分子量为57KD，有三个功能区，功能区1与P21和P27极相似，为CDK活性抑制区。p57kiP2对细胞的生长有着极其重要的调控作用，主要通过抑制CDK复合物的功能来实现其作用。它主要抑制Cyclin E-CDK2, Cyclin A-CDK2 和CyclinD-CDK2等Gl期和S期激酶复合物使细胞不能通过Gl期。一方面通过氨基端与Cyclin E- CDK2, CyclinA- CDK 2和Cyclin D- CDK 2等激酶复合物结合，抑制其对Rb蛋白的磷酸化,E2F不能释放而使细胞停滞于G1期;另一方面，通过抑制CDK2 Thr160的磷酸化而抑制CDK2的激活，还可通过梭基端与PCNA的结合，抑制细胞的增生[1]。p57kiP2负性调节细胞增生的生物学功能，提示它可能具有肿瘤抑制作用，而成为一个候选的肿瘤抑制基因。p57kip2基因缺失的小鼠呈现过度增长，肿瘤生长倾向和高频率的肿瘤转向，这说明p57kip2对抑制肿瘤的发生、发展有重要作用[2]。Ito等[3] 研究了p57kip2在37例肝外胆管癌(BDC)及28例肝内胆管癌(CCC)中的表达时发现二者的标记指数(Labeling Index, LI)分别为60.8±7.9,58.6±8.6，显著底于正常胆管上皮，二者有统计学差异(P< 0.01和P<0.05 )。且BDC, CCC中p57kip2低LI与肿瘤生物学侵袭性如低分化，淋巴结转移有关。Nakai等[4]应用免疫组化测定59例肝细胞性肝癌p57kip2的表达常丢失，特别在中低分化者中。研究p57kiP2在脑胶质瘤中表达及其与肿瘤细胞分化的关系是本课题研究的主要目的之一。

　　在此项研究发现，在50例脑胶质瘤患者中，p57kiP2蛋白阳性率为34% (17/50) ，10例正常脑组织p57kiP2蛋白阳性率为70% (7/10)，两者比较差异有显著性(P<0.05 )。分化较高(Ⅰ～Ⅱ)的脑胶质瘤组中p57kiP2蛋白表达阳性率高于分化较低(Ⅲ～Ⅳ)的脑胶质瘤组(P<0.05)。脑胶质瘤组织中p57kip2蛋白表达强度随着恶性程度的增高而降低。以上研究结果表明，高度恶性脑胶质瘤中p57kip2蛋白的低水平表达导致其负性调节细胞增生的生物学功能下降或丧失，从而引起肿瘤细胞的增殖失去抑制，最终导致脑胶质瘤的发生及恶性进展。提示p57kip2蛋白的表达下调在脑胶质瘤的发生及恶性进展过程中起重要作用。另有研究表明人类肿瘤中p57基因的突变是很罕见的，因此可以推断，p57kip2蛋白在肿瘤组织中的表达下调，其主要原因为它基因表达水平的改变[5]。研究表明，p57kip2蛋白的表达水平受多种机制的调控，如泛素化降解、抗增殖信号因子、细胞因子以及接触性抑制等[6]。在某些肿瘤中存在p57kip2基因印记缺失(loss of imprinting, LOI)或杂合型丢失(loss of heterozygosity, LOH )[7]。Polyak等[8] 在研究细胞间接触抑制和 TGF-β诱导细胞生长停滞于G1期的机制时，从静息的细胞抽提物中发现一个27kD的热稳定蛋白质,称之为p27kip1，它具有抑制cyclinE-CDK2复合物的活性，对细胞周期具负调控作用。Pietenpol等[9] 利用人p27 cDNA作探针筛选得到定位于人染色体12p13的p27基因,它包含2个外显子和2个内含子。人p27 cDNA长594bp.含198个氨基酸，是高度保守的蛋白分子、在人、鼠、貂中p27kip1的氨基酸序列具有90%的同源性。p27kip1主要与cyclin结合而发挥对cyclin- CDK的抑制作用。p27kip1对CDK的抑制作用有两方面，一方面p27kip1能抑制己结合到cyclin 并被激活的CDK活性;另一方面p27 kip1也可以抑制CDK的激活过程.最终抑制细胞周期G1S的转变。Ellis等[10] 在研究一组缺失了p27基因小鼠的食管粘膜上皮后发现其食管癌的发生率明显高于缺失者.二者比较差异显著。Y ang等[11] 将人类p27基因作为抗癌基因表达于HFR2基因过表达的细胞中，发现可以抑制该基因引起的细胞恶性转化。Hayashi等研究一组非小细胞肺癌后认为p27基因在肺腺癌的进展中扮演着重要角色。这些研究表明, p27基因成为抑癌基因的新成员,是一个肿瘤抑制因子。本研究发现，在50例脑胶质瘤患者中，p27kip1蛋白阳性率为38%(19/50) 。10例正常脑组织p27kip1蛋白阳性率为80%(8/10)，两者比较差异有显著性(P< 0.05 )。脑胶质瘤中高度恶性组(Ⅲ～Ⅳ) p27kip1蛋白阳性表达率低于低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ)，二者差异有显著性(P<0. 05)。Fiano等用免疫组化与Western印迹分析检测p27kip1在23例Ⅱ和Ⅲ级少突胶质瘤中的表达, 发现 p27kip1与病理级别呈负相关。Nakasu等证实，脑胶质瘤细胞p27kip1表达下降的同时，总伴随蛋白酶降解活性的上升，而蛋白酶抑制剂可缓解 p27kip1的降解，抑制p27kip1表达水平的下调。由此可以推论，脑胶质瘤细胞中p27kip1表达的改变主要取决于翻译后的代谢调节，而不是基因突变。p27kip1与肿瘤的相关性不表现在基因缺失或突变上，而是以其蛋白水平这样一种化学剂量关系起作用，与脑胶质瘤的发生和恶性进展有密切的关系。

　　总之，研究表明p57kip2蛋白和p27kip1蛋白的表达与胶质瘤的分化程度有关。在脑胶质瘤中p57kip2蛋白和p27kip1蛋白的表达下调，提示二者在G1/S期可能通过一定机制协同调节细胞周期进程，导致细胞活性的改变，促进肿瘤的发生和恶性进展。深入研究p57kip2蛋白与p27kip1蛋白的作用机制，将为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。

　　【参考文献】

　　[1] Watanabe H, Pan ZQ, Schreiber-Agus N, et al. Suppression of cell transformation by the cyclin dependent kinase inhibitor P57kip2 requires binding to proliferating cell nuclear antigen. [J] Bio-chemistry, 1998, 95(4):1392-1397

　　[2] 唐杰荣，王志明，等.p27kip1,p57kip2在甲状腺癌中的表达及临床意义，中国医师杂志，2004，11：1506-1507

　　[3] Ito Y, Takeda T, Sasald Y, et al. Expression of p57kip2 protein in extrahepatic bile duct carcinoma and intrehepatic cholangiogellular carcinoma[J].Liver,2002,22(2):145-149

　　[4] Nakai S, Masaki T, et al. Expression of p57kip2 in hepatocellular carcinoma : relationship between tumor differentiation and patient surrival . Int Joncol , 2002, 20(4):769

　　[5] Tsugu A, Sakai K, Dirks PB, et al. Expression of p57(KIP2) potently blocks the growth of human astrocytomas and induces cell senescence[J].Am J of Pathol,2000, 157(3):919

　　[6] Kamura T, Hara T, Kotoshiba S, et a1. Degradation of P57kip2 mediated by SCFSKP2-dependent ubiqitylation [J]. PNAS, 2003, 100(18):10231

　　[7] Matsuaka S, Thompson JS, Edwards MC, et al. Imprinting of the gene encoding a human cyclin-dependent kinase inhibitor, p57kip2,on chromosome 11p15.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(7):3023-3026

　　[8] Polyak K, Kato J, Soloman MJ, et al. Gences Dev,1994;8(1):9～22

　　[9] Pietenpol JA, Bohlander SK, Sato Y, et al .Cancer Res , 1995,55(4):1206～1212

　　[10] Ellis FH Jr, Xu X , Kulke M H, et al. Malignant transformation of the esophageal mucosa is enchanced in p27Knockout mice[J].J Thorac Cardiovase Surg,2001,122(4):809-814

　　[11] Yang HY, SHao R, Hung MC, et al.p27kip1 inhibits Her2/neumediated cell growth and tumorigenesis [J].Oncogence,2001,20(28):3695-3702