评价药物通过血脑屏障方法现状

　　作者：梁超,李安民　　作者单位：解放军总医院第一附属医院 神经外科，北京 100037

　　【摘要】血脑屏障是脑屏障最重要的组成部分，维持着中枢神经系统微环境的稳定，但同时也限制了多数药物进入脑组织对神经系统疾病的治疗作用。通过各种方法修饰药物使之能够进入脑组织成为药物学家的难题，而评价药物通过血脑屏障也成为其中一个重要课题。本文按实验对象类型分为动物活体、离体脑组织、体外血脑屏障模型、数学模型四大类进行综评。

　　【关键词】 血脑屏障;药物评价;药代动力学

　　中枢神经系统内神经元的正常功能活动需要其周围的微环境保持一定的稳定性，维持这种稳定性的结构称脑屏障。按其形态，脑屏障分三类：血-脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)，血-脑脊液屏障(bloodcerebrospinalfluid barrier)，脑脊液-脑屏障(cerebrospinalfluidbrain barrier)。其中，BBB为三者中最重要的组成部分。微观上BBB分三层结构，由内向外依次为(1)脑和脊髓内的毛细血管内皮，不同于外周毛细血管内皮的是，脑毛细血管内皮细胞之间为紧密连接，细胞吞饮泡很少，细胞内含有丰富的酶系统，其屏障作用分机械屏障和酶屏障[1];(2)毛细血管基膜;(3)胶质膜，即星形胶质细胞足突。

　　物质透过BBB主要有4条途径：水溶性小分子直接经细胞间隙扩散;脂溶性分子的跨膜扩散;特异受体介导的胞饮作用;特异载体通道和酶系统的激活[2]。

　　药物透过BBB的能力通常与药物本身的相对分子质量、脂溶性、荷电性、同血浆蛋白的结合能力以及特定的载体或受体转运系统有关。除水、电解质以及部分大分子物质可自由通过外，大多数能够透过BBB的药物(如左旋多巴、可待因等)则是通过载体介导转运入脑的，其机制包括：易化扩散、主动转运以及胞饮作用。亲水性、大分子的药物本身难以透过BBB，而一些亲脂性、分子量适宜的药物虽能透过血脑屏障，但易被血脑屏障上的P糖蛋白(Pgp)等外排泵转运出来，致脑内有效药物浓度低且作用时间短。

　　目前检测药物通过血脑屏障的方法按其实验对象主要分为四大类：动物活体、离体脑组织、体外血脑屏障模型、数学模型。

　　1 通过对动物活体检测以评价药物通过血脑屏障

　　1.1 监测脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF) 电镜显示，神经元除突触接触的部位是神经元间的连接外，其他部分几乎全被神经胶质细胞包围。神经元与神经胶质细胞之间的约数十纳米的间隙中充满着的细胞间液是神经元直接生存的微环境。但限于目前的研究方法，对此微环境的认识有限。在脑屏障的三个组成部分中，脑脊液-脑屏障最不完善，它可使CSF和脑内神经元的细胞外液互相交通。现一般认为物质一旦从血液进入CSF，便可自由扩散进入脑组织，多年来一直以CSF的变化来反映脑内神经元生存环境，监测CSF是筛查作用于脑组织的药物的重要手段[3]。Wang等[4]对神经外科手术后病人CSF中万古霉素的浓度用高效液相色谱分析(high performance liquid chromatography， HPLC)进行定量，结果提示CSF中万古霉素可达治疗浓度，可用于治疗术后颅内感染。

　　1.2 脑内微透析法(brain microdialysis method) 是一种连续灌注并采集清醒动物特定脑区灌流液的一种新方法。此技术由于是经置于脑内的半透膜收集标本，标本基本不含大分子蛋白质等物质，可直接应用于高效液相色谱测定，主要用于测定脑内细胞外液中神经递质[5]。Denora[6]在大鼠经腹腔注射多巴胺复合物后，用脑内微透析技术对其脑皮质多巴胺释出定量监测，发现皮质多巴胺释出呈剂量依赖性升高。

　　1.3 药物的放射性标记法 是以放射影像学方法来证实其通透血脑屏障。姚鹏等[7]对自制的磁性跨血脑屏障复合功能纳米载体微粒进行99Tc放射性同位素标记，经尾静脉注射标记过的磁性纳米粒子，并将大鼠的头部置于磁场下(1T)30 min， 然后通过单光子发射计算机断层显像仪 (single photon emission computed tomography，SPECT) 进行观察。SPECT示踪在大鼠脑部有放射性同位素锝存留。因游离态的锝不可能通过正常血脑屏障，故检测结果表明该载体系统成功携带99Tc跨过正常大鼠血脑屏障到达脑部。另外，正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)也被用于评定药物是否可通过血脑屏障[8]。

　　1.4 在活体动物进行药代观察也可间接证明药物透过血脑屏障的能力 达拉根是一种类似脑啡肽的物质，具有中枢镇痛作用，游离达拉根经体循环给药，无法过血脑屏障。Kreuter等[9]以小鼠弹尾试验检验所制纳米粒子携达拉根过血脑屏障的能力。所用注射液由载有达拉根的聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)纳米粒子分散液加入适量聚山梨酯80温浴30 min 制成。高浓度实验组药液能产生镇痛效力，而所设游离达拉根溶液等多个对照组均无效。证明表面经聚山梨酯80修饰后的纳米粒子能将达拉根顺利输送入脑。

　　对活体动物的观察监测可充分利用机体整体调节机制，等同于药物实际使用时的生理状况。但受限于时间、经费、技术条件等，难以进行大规模药物筛查，对药物过血脑屏障的生理、病理机制的观察研究存在局限性。另外，上述各种方法均有其局限，如以放射性元素标记后行影像学监测无法分辨是目标化合物还是其代谢产物显影;因脑细胞与脑脊液间还存在脑脊液-脑屏障，脑脊液监测仅是限于现有实验技术条件的权宜之计;脑内微透析法提取物是经微透析探针半透膜而来的局部细胞间液的小分子物质，无法反映整个大脑内的状况，且微透析探针可能致慢性BBB破坏而增加其通透性;而对活体动物药效观察仅为间接证据。

　　2 通过对离体脑组织检测以评价药物通过BBB

　　通过给药后对脑组织中的药物成分定性或定量评价，来验证其可通过BBB。常用的实验方法有单次颈动脉注射技术(single carotid injection technique)，原位脑灌流技术(insitu perfusion technique)，静脉注射技术(intravenous injection technique)等。影像学技术如定量放射自显影技术(quantitative autoradiography)，分析化学的技术如高效液相色谱分析以及电子显微镜(electron microscope)技术等常被联合运用来检测目标化合物。

　　2.1 常用的实验方法

　　2.1.1 单次颈动脉注射技术 该技术是将动物颈动脉置管后，把溶有待检药物和已行放射性标记的内对照物的林格液快速推注入颈总动脉(<0.5 s)，5～15 s 后断头，取脑，进行分析计算。混以内对照物目的是为了计算实际进入脑内的化合物的量。Oldendorf[10]用此法筛检了相对分子质量79～70 000的化合物，以14C标记化合物，3H标记H20为内对照物，发现化合物分子量>5 000者无法通过BBB，低pH(该实验中pH=2.5)时，BBB通透性增大。此技术操作快，适于高通量筛查，但因实验中未行外部动脉结扎，目标化合物可扩散到全身，且因时间限制，技术难度大。

　　2.1.2 原位脑灌流技术 该技术是对单次颈动脉注射技术的改进。麻醉动物后，结扎颈外动脉分支枕动脉、甲状腺上动脉，同时结扎颈内动脉翼突腭动脉。经颈外动脉输入药液，输入时需夹闭颈总动脉，输药完毕继续输入生理盐水10～30 s 以灌洗清除结合于脑内微血管壁上及微血管内皮细胞中尚未进入脑组织中的化合物。Bihorel[11]用原位脑灌流法检测P糖蛋白(Pgp)对甲磺酸伊马替尼在穿经小鼠BBB时的影响，实验中以3H标记菊粉，14C标记伊马替尼，通过液体闪烁计数进行定量。Pgp阻滞剂Valspodar和zosuquidar可提高小鼠脑对伊马替尼的摄取量2.5倍，这个结果同在Pgp缺乏的Mdr1a/1b(-/-)小鼠上的实验结果一致，后者为5.5倍。结果提示伊马替尼穿经BBB受限于Pgp。本技术敏感性高，可完全控制进入脑血管溶液的质量浓度，可以准确研究诸如pH值、离子、流速、蛋白质量浓度等因素对物质入脑吸收的影响，并且能够对局部脑灌流速度直接控制，另由于混入灌流液的血液干扰很少，可对脑血管转运进行正确测量[12]。但此方法技术操作难度大，完整实验所需动物数多，实验数据分析工作量大[13]。

　　2.1.3 静脉注射技术 该技术被誉为评价BBB通透性的“金标准”[13]。大或小鼠经股静脉或尾静脉置管，注入目标化合物及血浆体积标记物(用以校正脑微血管内的残存的目标化合物)，经股动脉置管于不同时间点取血。实验毕，杀死动物，测脑内化合物浓度。也可不予股动脉置管，直接杀死动物取血，同时测脑内化合物浓度。此操作也需清除结合于脑内微血管壁上及微血管内皮细胞中尚未进入脑组织中的化合物，可用右旋糖酐成分密度离心法来清除脑匀浆中微血管的可以有效地。当然，如果此化合物与微血管结合不紧密，可在脑组织匀浆过程中脱落下来，干扰实验结果。Saito[14]用此技术对载体介导的125IA beta 140进行大鼠脑摄取计算，其结果两倍于脑对吗啡的摄取，并且可结合于Alzheimer Disease病的脑内淀粉状蛋白上，以影像学技术显影而明确病变部位。此技术也有其局限，操作中目标化合物可能被代谢并分布于外周器官中，造成计算不准确。但仍被认为是最接近人体状况的技术[15]。

　　2.2 常用的检测方法

　　2.2.1 影像学方法包括放射自显影技术(autoradiography)、正电子发射断层扫描(positron emission tomography，PET)、单光子发射计算机断层扫描(single photon emission computed tomography，SPECT)等。本文仅论及放射自显影技术。

　　放射自显影技术原理是将放射性同位素(如14C和3H)标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。Charlton 等[16]将三种甘氨酸受体拮抗剂和一种血管紧张素Ⅱ拮抗剂分别经鼻腔黏膜或静脉给药，用放射自显影技术显影并定量三种甘氨酸受体拮抗剂在脑内和脑脊液中的分布，用显微放射自显影技术显示药物经嗅神经的药物分布。实验结果提示经鼻腔给药较经静脉给药可更有效地将实验药物传送入嗅脑及大脑组织，并且提示药物的神经-嗅黏膜入脑通路是经细胞旁路进行的。

　　影像学方法有一个共同的缺陷，即无法分辨是目标化合物还是其代谢产物显影[15]。

　　2.2.2 电子显微镜技术是少有的可对通过BBB的化合物进行直接观察的手段。自1967年Reese等用电子显微镜对辣根过氧化酶的脑内分布观察以来，此技术在评价药物通过生理或病理状况下的BBB方面得到广泛应用。本技术过程较烦琐，包括动物研究、标本采集，组织染色等多项步骤。

　　2.2.3 分析化学的各种技术多用以鉴定脑组织中目标化合物，主要有高效液相色谱分析(HPLC)、色谱-质谱联用(LCMS)等。

　　高效液相色谱分析具有分离效率高，选择性好，分析速度快，灵敏度高等特点，在物质检测分析中广泛运用。Kang[17]以HPLC结合脑内微透析法测定生物素化的肽bio[3H]DALDA以及共价结合了转铁蛋白受体单抗OX26或抗生物素蛋白链菌素bio[3H]DALDA的脑内分布。

　　色谱-质谱联用(LCMS)为分析化学中最成熟的一类联用技术。其中色谱方法是效率极高的分离手段，而质谱法是强有力的定性鉴别和结构分析方法，二者联用，取长补短。其中又分气相色谱-质谱联用及高效液相色谱-质谱联用等多种。Obradovic[18]用原位脑灌流法并LCMS技术分析了第一代抗组胺药及第二代抗组胺药的通过血脑屏障能力。

　　3 通过对体外血脑屏障模型(bloodbrain barrier model，BBBM)检测以评价药物通过BBB

　　1973年Joó分离了脑微血管碎段，并发现新鲜分离的血管碎段中脑微血管内皮细胞(brain microvessl endothelial cell，BMEC)的紧密连接、缺少窗孔结构等特点得到较好保留。之后脑血管碎段BBBM在实验中得到应用，并进一步优化为BMEC模型、BMEC和星形胶质细胞共同培养模型。外膜细胞(Pericyte)在模型中的重要作用也得到了重视[19]。Smith[20]用猪脑微血管内皮细胞并星形胶质瘤细胞培养出了可长期保存且保留大量活体BBB特征(如紧密连接复合体、囊泡结构、紧密连接转运子、ABC转运蛋白、来普汀受体等)的离体BBBM。Pastan[21]培养非脑源性的转染了多药耐药基因(MDR1)的MadinDarby 犬科肾细胞BBBM。

　　BBBM由于其省时省力、可部分取代实验动物等特点，而得到广泛应用。Mahajan[22]用脑微血管内皮细胞为BBBM研究了甲基苯丙胺(冰毒)和(或)HIV1病毒蛋白gp120对BBBM上紧密连接蛋白ZO1，JAM2等的表达的影响，发现二者均可显著提高免疫细胞跨BBB的穿内皮细胞转运能力。而gp120有神经毒性和细胞毒性，这在HIV1痴呆的病程进展中已被证实。这对滥用甲基苯丙胺的HIV1痴呆患者治疗策略的修正非常重要。Jallouli[23]以猪脑毛细血管内皮细胞(BCEC)为BBBM，以125I标记精蛋白-寡聚核苷酸纳米粒子，发现被载脂蛋白AI修饰的精蛋白-寡聚核苷酸纳米粒子跨BCEC能力为其裸药的两倍，对BCEC上B类Ⅰ型清道夫受体(为BCEC上主要的高密度脂蛋白/载脂蛋白AI受体)阻滞可将其跨BCEC能力降低到同裸药的水平。提示载脂蛋白AI修饰粒子的技术可用以实现跨BBB靶向给药。GarciaGarcia[24]以大鼠脑内皮细胞和星形胶质细胞共同培养的BBBM来检测聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEGPHDCA)纳米粒子的跨BBB能力，对照活体大鼠经静脉给药后该纳米粒子的跨BBB能力，发现二者有良好相关性，提示前者可用以进一步研究纳米粒子跨BBB机制，进而设计新型脑内转运胶体载体体系。Culot[25]培养脑毛细血管内皮细胞和胶质细胞的BBBM对10种化合物进行试验，该模型显示了良好的体外/体内相关性(R(2)=0.81)。

　　近来，BBBM在很多实验中取代活体动物，省时省力，且避免了伦理学上的争议，在研究药物通过BBB的动力学方面得到广泛应用。但也有其局限性，如培养过程中BBB特异转运体表达逐渐减弱，缺乏机体整体的神经-体液调节制约机制等。

　　4 通过建立数学模型来虚拟筛选、评价药物透过血脑屏障能力

　　该方法可以有效缩短新药的研发时间，受到越来越多的关注。但该方法属生物医学工程范畴，且只适用于大量候选药物能否透过血脑屏障的筛选，最终还需动物实验来进一步证实，此处不赘述。

　　5 结语

　　评价药物通过血脑屏障是一个复杂的过程，本文所总结的评价药物通过血脑屏障的技术、方法各有其优点、缺点，有的评价方法本身即是限于目前技术水平的权宜之计，有其自身的缺陷。没有哪种方法可以适用于所有药物。在实际使用中，可以在实验精度允许范围内，尽量利用各种药物的理、化性质及其生物学效应的特点来挑选、设计实验方案，达到又快又好地完成评价任务。

　　【参考文献】

　　[ 1] Pollay M，Roberts PA.Bloodbrain barrier a definition of normal and altered function[J].Neurosurgery，1980，6(6)：675-685.

　　[ 2] Lockman PR，Mumper RJ，Khan MA，et al.Nanoparticle technology for drug delivery across the bloodbrain barrier[J].Drug Dev Ind Pharm，2002，28(1)：1-13.

　　[ 3] Lin JH.CSF as a surrogate for assessing CNS exposure: an industrial perspective[J].Curr Drug Metab，2008,9(1)：46-59.

　　[ 4] Wang Q,Shi Z, Wang J,et al.Postoperatively administered vancomycin reaches therapeutic concentration in the cerebral spinal fluid of neurosurgical patients[J].Surg Neurol，2008，69(2)：126-129.

　　[ 5] 张庆柱.在体脑组织递质释放研究方法[M]//张均田，张庆柱.神经药理学研究技术与方法.北京：人民卫生出版社.2005:60-61.

　　[ 6] Denora N，Laquintana V，Lopedota A，et al.Novel LDopa and dopamine prodrugs containing a 2phenylimidazopyridine moiety[J].Pharm Res，2007，24(7)：1309-1324.

　　[ 7] 姚 鹏, 黄 杰, 康春生，等.跨血脑屏障复合功能纳米载体系统的构建[J].中国医学科学院学报，2006，8(4)：481- 485.

　　[ 8] Josserand V，Pélerin H，de Bruin B，et al.Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human bloodbrain barrier[J].J Pharmacol Exp Ther，2006，316(1)：79-86.

　　[ 9] Kreuter J，Alyautdin RN，Kharkevich DA，et al.Passage of peptides through the bloodbrain barrier with colloidal polymer particles (nanoparticles)[J].Brain Res，1995，674(1)：171-174.

　　[10] Oldendorf WH, Stoller BE, Tishler TA，et al.Transient bloodbrain barrier passage of polar compounds at low pH Am J Physiol[J].Am J Physiol，1994，267(6 Pt 2)：H2229-2236.

　　[11] Bihorel S, Camenisch G, Lemaire M，et al.Influence of breast cancer resistance protein (Abcg2) and pglycoprotein (Abcb1a) on the transport of imatinib mesylate (Gleevec) across the mouse bloodbrain barrier[J].J Neurochem，2007 ，102(1)：1749-1757.

　　[12] Allen DD，Smith QR.Characterization of the bloodbrain barrier choline transporter using the in situ rat brain perfusion technique[J].J Neurochem，2001，76(4)：1032-1041.

　　[13] Smith QR，Allen DD.In situ brain perfusion technique[M]//Nag, S.The bloodbrain barrier: biology and research protocols.2nd Edition.Totowa, NJ.Humana Press Inc，2003:209-218.

　　[14] Saito Y，Buciak J，Yang J，et al.Vectormediated delivery of 125Ilabeled betaamyloid peptide A beta 140 through the bloodbrain barrier and binding to Alzheimer disease amyloid of the A beta 140/vector complex[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(22)：10227-10231.

　　[15] Nicolazzo JA,Charman SA,Charman WN.Methods to assess drug permeability across the bloodbrain barrier[J].J Pharm Pharmacol，2006，58(3)：281-293.

　　[16] Charlton ST，Whetstone J，Fayinka ST，et al.Evaluation of direct transport pathways of glycine receptor antagonists and an angiotensin antagonist from the vasal cavity to the central vervous system in the rat model[J].Pharm Res，2008 25(7)，1531-1543.

　　[17] Kang YS，Voigt K，Bickel U. Stability of the disulfide bond in an avidinbiotin linked chimeric peptide during in vivo transcytosis through brain endothelial cells[J].J Drug Target，2000，8(6)：425-434.

　　[18] Obradovic T，Dobson GG，Shingaki T，et al.Assessment of the first and second generation antihistamines brain penetration and role of Pglycoprotein[J].Pharm Res，2007，24(2)：318-327.

　　[19] Lai CH, Kuo KH.The critical component to establish in vitro BBB model: Pericyte[J].Brain Res Brain Res Rev，2005，50(2)：258-265.

　　[20] Smith M，Omidi Y，Gumbleton M.Primary porcine brain microvascular endothelial cells: biochemical and functional characterisation as a model for drug transport and targeting[J].J Drug Target，2007，15(4)：253-268.

　　[21] Pastan I，Gottesman MM，Ueda K，et al.A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of Pglycoprotein in MDCK cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85(12)：4486-4490.

　　[22] Mahajan SD，Aalinkeel R，Sykes DE，et al.Methamphetamine alters blood brain barrier permeability via the modulation of tight junction expression: Implication for HIV1 neuropathogenesis in the context of drug abuse[J].Brain Res，2003：133-148.

　　[23] Jallouli Y，Paillard A， Chang J，et al.Influence of surface charge and inner composition of porous nanoparticles to cross bloodbrain barrier in vitro[J].Int J Pharm，2007，344(1-2)：103-109.

　　[24] GarciaGarcia E，Gil S，Andrieux K，et al.A relevant in vitro rat model for the evaluation of bloodbrain barrier translocation of nanoparticles[J].Cell Mol Life Sci， 2005，62(12)：1400-1408.

　　[25] Culot M，Lundquist S，Vanuxeem D，et al.An in vitro bloodbrain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening[J].Toxicol In Vitro，2008， 22(3)：799-811.