生存素反义寡核苷酸对人脑胶质瘤U87细胞株MMP-2及TIMP-2表达的影响

　　作者：高广中1,黄俊星2,肖蔚3,戴桂红　　作者单位：泰州市人民医院 1.神经外科，2.肿瘤科，3.病理科，江苏 泰州

　　【摘要】目的：研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)对人脑胶质瘤U87细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表达的影响，探讨生存素ASODN治疗胶质瘤的可行性。方法： 经脂质体介导将生存素ASODN转染人脑胶质瘤细胞株U87，用荧光显微镜检测转染效率，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染细胞生存素、MMP-2及TIMP-2表达改变。结果：荧光显微镜检测结果显示生存素ASODN可成功转染U87细胞。与对照组相比，转染组细胞生存素、MMP-2、TIMP-2 mRNA和蛋白的表达均显著降低。结论：生存素ASODN转染可有效抑制U87细胞生存素基因的表达，并降低其MMP-2、TIMP-2表达，生存素ASODN可能用于胶质瘤基因治疗。

　　【关键词】 生存素;反义寡核苷酸;基质金属蛋白酶-2;基质金属蛋白酶组织抑制因子-2;人脑胶质瘤细胞

　　[Abstract]　Objective： To investigate the effect of survivin antisense oligodeoxynucleotide(ASODN) transfection on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in human brain glioma cell line U87 and to provide experimental foundation for survivin ASODN gene therapy for glioma. Methods： Survivin ASODN was transfected into U87 cells through lipofectin. The rate of transfection was detected by fluorescence microscopy. The expressions of survivin， MMP-2 and TIMP-2 in transfected cells were detected by RT-PCR and Western blot. Results： Survivin ASODN was successfully transfected into U87 cells. After the transfection， RT-PCR and Western blot analysis revealed that the expressions of survivin， MMP-2 and TIMP-2 mRNA and their proteins of antisense group were decreased significantly， compared with the control group . Conclusion： The transfection of survivin ASODN could effectively down-regulate the expressions of survivin， MMP-2 and TIMP-2 in U87 cell. Survivin ASODN may provide potential gene therapy for glioma.

　　[Key words]　survivin; antisense oligodeoxynucleotide; matrix metalloproteinase-2; tissue inhibitor of metalloproteinase-2; human brain glioma cell

　　脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占所有脑肿瘤的40%～50%，具有恶性度高、易复发、预后差等临床特点[1]。目前，胶质瘤以手术切除为主结合放疗、化疗的综合治疗措施尚未取得满意疗效，尤其是高度恶性的胶质母细胞瘤经正规治疗后平均生存期仅6～12个月[2]。因此深入阐明胶质瘤侵袭和转移的分子机制，对于寻找新的干预靶点，为胶质瘤的治疗提供新的线索具有重要意义。生存素(survivin)是近年来发现的一种凋亡抑制蛋白，是凋亡抑制家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能。研究表明，生存素在脑胶质瘤组织中高表达，而在瘤旁组织和正常脑组织中并不表达，与胶质瘤的发生、病程进展及预后密切相关[3]，这使靶向生存素的基因治疗在脑胶质瘤中的应用成为可能。本实验采用反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)细胞转染技术，观察转基因胶质瘤细胞株U87基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)表达的改变，以进一步阐明生存素在胶质瘤侵袭和转移中的作用及机制，为实施胶质瘤基因治疗提供理论和实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要材料

　　人脑胶质瘤细胞株U87购于中国科学院上海细胞生物研究所;RPMI-1640、胎牛血清、RT-PCR试剂盒购于Gibco公司;Lipofectamine 2000转染试剂盒及Trizol试剂购于Invitrogen公司;cDNA PCR试剂盒购于Clontech公司;兔抗人生存素多克隆抗体、鼠抗人MMP-2多克隆抗体及鼠抗人TIMP-2多克隆抗体购于DAKO公司;ABC试剂盒购于Vector公司。生存素反义寡核苷酸由上海生工有限公司合成，生存素ASODN序列5′-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3′(232～251 bp)，首尾3个磷酸键硫化修饰，其中5个D(260 nm)的寡核苷酸(ODNs)5′端标记异硫氰酸荧光素(FITC)。PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

　　1.2　细胞培养及转染

　　人脑胶质瘤细胞株U87培养在含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37 ℃，5%CO2培养箱常规培养，用0.25%胰酶消化传代。取处于对数生长期的细胞，将细胞以5×105个/孔接种于6孔板内，到呈现60%～70%融合生长时进行实验。10 μl Lipofectamine 2000和4 μg ASODN分别稀释于250 μl RPMI-1640中;将Lipofectamine 2000稀释液缓慢滴加到ASODN稀释液中，边滴加边混匀;室温孵育20 min。反义组每孔加入Lipofectamine 2000/ASODN复合物250 μl;空脂质体组每孔加入等量Lipofectamine 2000稀释液;空ASODN组每孔加入等量ASODN稀释液;空白对照组每孔加入同体积RPMI-1640，继续培养24～48 h。

　　1.3　荧光显微镜观察ASODN在细胞内的分布

　　转染24 h后收集各组细胞爬片，PBS冲洗，中性甲醛固定，封固后荧光显微镜下观察细胞内荧光分布。

　　1.4　RT-PCR法与蛋白质印迹法检测转染细胞生存素表达

　　1.4.1　RT-PCR法

　　转染24～48 h后取各组标本，用Trizol抽提总RNA，分光光度计检测RNA浓度及纯度，逆转录成cDNA，等量cDNA依照PCR试剂盒提供的步骤进行PCR。PCR引物序列：内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游5′-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3′;下游5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，预计扩增片段长度为450 bp。生存素上游5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′;下游5′-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3′，预计扩增片段长度为338 bp。反应条件为94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共33个循环。

　　1.4.2　蛋白质印迹法

　　转染24～48 h后取各组标本，弃完全培养液，PBS洗2次，按本实验室常规方法提取蛋白[4]。20 μl蛋白依标准方法进行8% SDS-PAGE变性电泳，转移至PVDF膜。一抗兔抗人生存素多克隆抗体(1 ∶200)，二抗为生物素化山羊抗兔(1 ∶500，ABC试剂盒)。

　　1.5　RT-PCR法检测转染细胞MMP-2及TIMP-2 mRNA

　　转染24 h后取各组标本，用Trizol抽提总RNA，PCR方法同“1.4.1”。PCR引物：内参照GAPDH同“1.4.1”。MMP-2上游5′-CTCAGCGGCTCATGGTCCGGCC-3′;下游5′-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3′，预计扩增片段长度为278 bp。TIMP-2上游5′-CTGTCCCCTCBCCTCTTCGC-3′;下游5′-TCCACCTCCTTCTCGCTCACTG-3′，预计扩增片段长度为303 bp。反应条件为94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共32个循环。

　　1.6　蛋白质印迹法检测转染细胞MMP-2及TIMP-2蛋白

　　转染24 h后取各组标本，提取蛋白，取20 μl蛋白依标准方法分别作8% SDS-PAGE变性电泳，转移至PVDF膜。一抗分别为鼠抗人MMP-2多克隆抗体及鼠抗人TIMP-2多克隆抗体(1 ∶200)，二抗为生物素化兔抗鼠IgG(1 ∶500)。

　　1.7　定量和统计分析

　　凝胶电泳用Kodak凝胶成像仪进行拍照记录，Kodak图像分析软件测定条带的灰度。应用SPSS13.0软件包对数据进行标准差计算，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　2.1　转染效率

　　荧光显微镜下观察各组细胞内荧光分布，结果显示反义组细胞内可见大量绿色荧光，呈离散型、点状分布，空ASODN组仅少量细胞见微弱荧光，空脂质体组细胞内未见荧光。

　　2.2　生存素 ASODN转染对U87细胞生存素mRNA及蛋白表达水平的影响

　　RT-PCR结果显示，反义组生存素mRNA表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=2.586，P<0.01)，空ASODN组和空脂质体组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，在338 bp处显示特异性的生存素mRNA条带。蛋白质印迹结果显示，反义组生存素蛋白表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=2.731，P<0.01);空ASODN组和空脂质体组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，显示相对分子质量为16 500蛋白条带。表明生存素ASODN转染能显著降低U87细胞生存素mRNA及蛋白的表达。1：DNA标准参照物;2：反义组24 h;3：反义组48 h;4：空ASODN组;5：空脂质体组　RT-PCR法检测转染细胞生存素mRNA的表达

　　2.3　生存素ASODN转染对U87细胞MMP-2 mRNA及蛋白表达水平的影响

　　RT-PCR结果显示，反义组MMP-2 mRNA表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=3.258，P<0.01);而空ASODN组和空脂质体组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在278 bp处显示特异性的MMP-2 mRNA条带。蛋白质印迹结果显示，反义组MMP-2蛋白表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=3.461，P<0.01);空ASODN组和空脂质体组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，显示相对分子质量为66 000蛋白条带。1：反义组24 h;2：反义组48 h;3：空ASODN组;4：空脂质体组　蛋白质印迹法检测转染细胞生存素蛋白的表达1：DNA标准参照物;2：空ASODN组;3：空脂质体组;4：反义组24 h　RT-PCR法检测转染细胞MMP-2 mRNA的表达1：空ASODN组;2：空脂质体组;3：反义组24 h　蛋白质印迹法检测转染细胞MMP-2蛋白的表达

　　2.4　生存素ASODN转染对U87细胞TIMP-2 mRNA及蛋白表达水平的影响

　　RT-PCR结果显示，反义组TIMP-2 mRNA表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=3.857，P<0.01);空ASODN组和空脂质体组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，在303 bp处显示特异性的TIMP-2 mRNA条带。蛋白质印迹结果显示，反义组TIMP-2蛋白表达显著低于空ASODN组和空脂质体组(F=3.692，P<0.01)，空ASODN组和空脂质体组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，显示相对分子质量为21 000蛋白条带。1：反义组24 h;2：空ASODN组;3：空脂质体组;4：DNA标准参照物　RT-PCR法检测转染细胞TIMP-2 mRNA的表达1：空ASODN组; 2：空脂质体组; 3：反义组24 h　蛋白质印迹法检测转染细胞TIMP-2蛋白的表达

　　3　讨　论

　　生存素作为凋亡蛋白抑制因子家族的一个新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重作用。人生存素基因全长14.7 kb，位于17q25染色体，其编码区包含426个碱基的开发阅读框，序列与ERP-1的序列呈反向互补，包含4个外显子和3个内含子，其蛋白含有142个氨基酸，相对分子质量为16 500[5]。研究显示，生存素广泛表达于人类各种肿瘤组织，而终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)未见表达，生存素的表达与肿瘤的分化及预后密切相关，通过下调生存素的表达可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖与进展[6]。当前，关于生存素在肿瘤发生、发展中的作用研究主要集中在对肿瘤细胞凋亡的抑制方面，而有关生存素在肿瘤浸润和转移中所起的作用及相关机制研究甚少。研究发现生存素阳性的胰腺癌患者发生神经浸润的概率显著高于阴性者[7]。Lee等[8]报道子宫内膜癌生存素的表达水平与癌细胞的恶性程度和肌层浸润深度有关，其水平上调可能赋予肿瘤细胞更多的生长优势和浸润、转移潜能。Zhen等[9]研究发现生存素在人脑胶质瘤中高表达且与肿瘤恶性程度密切相关。

　　大量研究表明，胶质瘤的发生、发展与多基因异常有关，胶质瘤的侵袭及转移涉及到各型蛋白水解酶对细胞外基质的降解及组织重塑，而基质溶解酶系统是这一过程中起最主要作用的蛋白水解酶类[10]。基质溶解酶系统由一个庞大蛋白溶解酶家族组成，也称基质金属蛋白酶系统，包括MMPs及相应抑制剂TIMPs，其中MMPs的表达异常与多种恶性肿瘤的侵袭和转移关系极为密切[11]。MMP-2又称Ⅳ型胶原酶，为MMPs家族中重要一员，其主要功能是降解细胞外基质中Ⅳ型胶原，故在肿瘤的浸润与转移过程中发挥极其重要的作用，而TIMP-2的主要功能是调节MMP-2的活性[12]。有学者研究发现，降低生存素的表达可以促进人脑胶质瘤细胞的凋亡，而抑制其侵袭能力，其机制与MMP-2表达的减少有关[13]。本研究以生存素基因为靶点，设计合成特异性的针对生存素基因的ASODN序列，将ASODN转染人U87细胞内，通过荧光显微镜观察各组细胞，证实在脂质体介导下，生存素ASODN可成功转染U87细胞。通过RT-PCR和蛋白质印迹检测生存素mRNA及蛋白表达，发现反义组生存素基因表达明显低于空脂质体组和空ASODN组，证实生存素ASODN转染可有效抑制生存素表达。本实验结果还发现与空脂质体组和空ASODN相比，反义组MMP-2及TIMP-2表达均显著降低，表明生存素也介导了U87细胞基质金属降解酶系统的代谢过程。尽管目前有关胶质瘤细胞内TIMP-2表达的改变尚无定论，但本实验结果显示，反义组MMP-2及TIMP-2的表达均降低，提示胶质瘤细胞内MMP-2与TIMP-2的表达之间可能存在某种反馈机制，值得今后进一步深入研究。

　　以上研究结果提示，在生存素ASODN转染有效抑制U87细胞生存素表达后，下调胶质瘤细胞MMP-2及TIMP-2的表达，进而抑制胶质瘤的侵袭和转移。尽管对生存素的作用机制尚未阐明，但生存素基因在胶质瘤中高表达的特性及通过下调生存素的表达可抑制胶质瘤的进展显示，随着对生存素作用机制研究的不断深入，生存素靶向治疗有可能成为治疗脑胶质瘤的一个新的途径。

　　【参考文献】

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　　[ 9 ]　Zhen HN，Zhang X，Hu PZ，et al. Survivin expression and its relation with proliferation， apoptosis， and angiogenesis in brain gliomas [J].Cancer,2005,104(12)：2775-2783.

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　　[13]　Chen F， Xu Y， Luo Y， et al. Down-regulation of Stat3 decreases invasion activity and induces apoptosis of human glioma cells[J]. J Mol Neurosci,2010,40(3)：353-359.