CD147、MMP-9和VEGF在垂体瘤中的表达及与其生物学行为的关系

　　作者：曲鑫,曲元明,张泽香,徐广明,陈刚　　作者单位：山东大学山东省立医院神经外科， 济南 250021

　　【摘要】目的 探讨CD147、MMP-9和VEGF在垂体腺瘤中的表达及其与垂体腺瘤侵袭性的相关性。方法 应用免疫组化SP法对50例垂体腺瘤标本的CD147、MMP-9及VEGF表达进行检测，分析其表达与垂体腺瘤侵袭性的关系及其三者间的相关性。结果 CD147在侵袭性垂体腺瘤中的强阳性及总阳性表达率分别为51.7%和93.1%，明显高于非侵袭性垂体腺瘤中的23.8%和52.4%(P<0.05);MMP-9在侵袭性垂体腺瘤中的强阳性及总阳性表达率分别58.6%和86.2%，明显高于非侵袭性垂体腺瘤中的14.3%和42.9%(P<0.05);VEGF在侵袭性垂体腺瘤中的强阳性及总阳性表达率分别为62.1%和96.6%，明显高于非侵袭性垂体腺瘤19.1%和57.1%(P<0.05);侵袭性垂体腺瘤组中的CD147、MMP-9和VEGF表达两两呈正相关(P<0.05),非侵袭性垂体腺瘤组中CD147、MMP-9和VEGF表达无明显相关性。结论 CD147、MMP-9及VEGF的高表达与垂体腺瘤的侵袭性密切相关，可作为判断垂体腺瘤侵袭性生长的有效指标;在肿瘤侵袭生长过程中，CD147与MMP-9、VEGF的产生有关，VEGF与MMP-9可能存在协同作用，共同促进垂体腺瘤侵袭性生长。

　　【关键词】 白细胞分化抗原147;基质金属蛋白酶-9;血管内皮生长因子;垂体肿瘤;侵袭

　　Expressions of CD147, MMP-9 and VEGF in pituitary adenomas and relationship with biological behavior

　　QU Xin， QU Yuan-ming， ZHANG Ze-xiang， XU Guang-ming, CHEN Gang,REN Jin-lin, MU Cheng-zhi, WANG Guo-dong

　　(Department of Neurosurgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　Abstract: Objective To explore the protein expressions of CD147, MMP-9 and VEGF in pituitary adenomas and to study the biological relationships between CD147, MMP-9, and VEGF and the invasiveness of pituitary adenomas. Methods The expressions of CD147, MMP-9 and VEGF in 50 cases were determined by the immunohistochemical SP method. Correlation among CD147, MMP-9 and VEGF, and correlation between the expressions of CD147, MMP-9 and VEGF and invasiveness of pituitary adenomas were studied. Results The intense expression and total expression rates of CD147 of pituitary adenoma patients with invasion were significantly higher than those without invasion (51.7% vs 23.8% and 93.1% vs 52.4%, P<0.05). The intense expression and total expression rates of MMP-9 in pituitary adenoma patients with invasion were significantly higher than those without invasion (58.6% vs 14.3% and 86.2% vs 42.9%, P<0.05). Also the intense expression and total expression rates of VEGF in pituitary adenoma patients were significantly higher than those without invasion(62.1% vs 19.1% and 96.6% vs 57.1%,P<0.05). There were mutually positive correlations among CD147, MMP-9 and VEGF expressions in invasive pituitary adenomas. Conclusion The high expression of CD147, MMP-9 and VEGF might relate to the aggressiveness and invasion in pituitary adenomas and may be useful markers for predicting invasiveness. In the process of invasive growth, CD147 has some relation to MMP-9 and VEGF, and MMP-9 and VEGF may act together.

　　Key words: Cluster of differentiation147; Matrix metalloproteinase-9; Vascular endothelial growth factor; Pituitary neoplasms; Invasion

　　垂体腺瘤属于良性肿瘤，一般不发生转移，但约有30%侵入到周围结构。该类肿瘤根治较困难，手术难以全切除，术后复发率高。CD147又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,　EMMPRIN)，是近年发现的细胞表面粘附因子，具有刺激产生金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的作用，影响肿瘤的侵袭和转移[1]。在MMPs的亚族中，MMP-9与垂体腺瘤侵袭性关系最为密切[2-3]。肿瘤的血管生成与肿瘤生长和转移密切相关，而血管内皮生长因子(VEGF)是目前所知的作用最强的促血管生成因子之一，在肿瘤的形成中起着重要作用[4]。本研究应用免疫组化法检测垂体瘤中CD147、MMP-9和VEGF蛋白的表达，探讨其表达与侵袭性垂体腺瘤的关系及其三者间的联系，进一步明确垂体腺瘤侵袭性的发生机制，为临床上侵袭性垂体腺瘤的诊治提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床材料 收集2006年2月至2007年4月期间山东省立医院神经外科的垂体腺瘤手术标本(手术时取所需组织，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋)50例，其中男26例，女24例，18～71岁，平均(38.3±1.3)岁;29例为侵袭性，21例为非侵袭性垂体腺瘤，均经手术治疗和病理检查确诊,分为侵袭组和非侵袭组。

　　侵袭性垂体腺瘤的判断标准: ① 结合Wilson改良的Hardy[5]分类法及Knos[6]分级、分期标准，判断垂体腺瘤侵袭性。本研究中将Wilson改良的Hardy分类法III-IV级或C, D, E期和/或Knosp2级以上作为垂体腺瘤侵袭性的判断标准;②　术前影像学改变，CT及MRI可见海绵窦、鞍旁及下丘脑等邻近结构的破坏;③　术中所取鞍底骨质或邻近硬脑膜经病理学证实有肿瘤细胞侵犯;④　术中见鞍底骨质及硬脑膜被侵袭破坏,肿瘤突入蝶窦腔或侵入鞍旁的血管神经。符合其中之一者即可确定为侵袭性腺瘤。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学法(SP法)步骤 将垂体腺瘤石蜡标本制成4微米厚切片，常规二甲苯脱蜡、酒精水化后，浸入3% H2O2溶液中，室温下孵育10 min，蒸馏水冲洗干净后，电炉或者水浴锅加热0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95 ℃左右，放入切片加热10～15 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，分别滴加鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人MMP-9单克隆抗体、兔抗人CD147多克隆抗体，在37 ℃恒温箱中孵育2 h。经磷酸盐缓冲液PBS冲洗3次各5 min后，滴加生物素标记的二抗体，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。以乳腺癌标本染色作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗染色作为阴性对照(本试验所用试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2.2 判断标准 CD147以细胞质或胞膜出现黄色或黄褐色颗粒为阳性，MMP-9以细胞质内出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性，VEGF以细胞质出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性。在高倍视野(×400)下,每张切片随机观察5个视野的肿瘤细胞,计算200个肿瘤细胞免疫反应阳性的细胞百分比，根据半定量免疫组织化学方法，对CD147、MMP-9及 VEGF反应阳性细胞显色强度及范围进行评价：① 阴性(-)：无阳性细胞染色; ② 弱阳性(+)：阳性细胞小于25%或显色浅;③ 中度阳性(++)：阳性细胞在26%～50%或染色略深;④ 强阳性(+++)：阳性细胞大于50%或显色深。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS软件(11.5版本)进行统计学分析。对侵袭性与非侵袭性组间数据进行χ2检验分析，CD147、MMP-9与VEGF表达之间的关系采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化显色结果 。可见，CD147主要在垂体腺瘤细胞质中表达，为黄褐色颗粒，MMP-9主要在腺瘤细胞质和细胞核中表达，为棕黄色颗粒，VEGF主要在细胞质中表达，为黄褐色颗粒。可见，在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中CD147的强阳性表达率和总阳性表达率差异均具有统计学意义(分别为χ2=3.95,P<0.05和χ2=11.07,P<0.05);MMP-9的强阳性表达率和总阳性表达率差异均具有统计学意义(分别为χ2=9.98,P<0.05和χ2=10.52,P<0.05);VEGF的强阳性表达率和总阳性表达率差异均有统计学意义(分别为χ2=9.15,P<0.05和χ2=11.82,P<0.05)。

　　CD147、MMP-9、VEGF在侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达(×400)

　　A：CD147; B: MMP-9; C: VEGF

　　Fig.1 Positive expressions of CD147, MMP-9 and VEGF in invasive pituitary adenomas(×400)

　　A：CD147; B: MMP-9; C: VEGF

　　CD147、MMP-9、VEGF在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中的表达

　　*P<0.05 vs 非侵袭组

　　2.2 相关分析 Pearson相关分析显示，侵袭性垂体腺瘤中CD147与MMP-9存在正相关(r=0.373,P<0.05);VEGF和MMP-9存在正相关(r=0.781,P<0.01);CD147与VEGF亦存在正相关(r=0.509,P<0.01),而非侵袭性垂体腺瘤组中CD147、MMP-9与 VEGF的蛋白质表达无相关性(P>0.05)。

　　3 讨论

　　肿瘤的侵袭转移是一个多步骤的复杂过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间复杂的相互作用，多种基因及其产物参与这一过程的调控。CD147是一种高度糖基化的、广泛表达于造血及非造血细胞系，分子量为50～60 kD的跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家庭(immunoglobulin superfamily ,IGSF)成员。CD147 在体内分布非常广泛 , 使之能参与体内多种生理过程并具有多种不同的生理功能。CD147在肿瘤细胞扩散转移中的作用可概括为以下几点:① 参与细胞与细胞的粘附，通过肿瘤微环境中MMPs含量及活性的改变，破坏天然组织机械屏障，利于癌细胞浸润、转移和肿瘤新生血管生成;② 参与细胞与基质的粘附，通过与α3β1、α6β1形成复合体，和基质蛋白相互作用，降解基质成份，促进癌细胞的扩散转移;③ 通过CD147胞内羧基端结构的改变，影响细胞内骨架蛋白Catenin、F-actin的聚集和解聚，参与细胞的运动和伪足的形成。其发挥作用的主要途径是通过刺激肿瘤细胞和基质细胞分泌和活化MMPs[7]。CD147在多种肿瘤细胞中表达增强[8]，在部分肿瘤中随着肿瘤恶性程度的增高，CD147表达也随之增多，且与肿瘤的浸润和转移相关。本研究采用免疫组织化学方法对CD147的表达进行了分析，结果显示，侵袭性垂体腺瘤组中CD147的表达明显高于非侵袭性组，说明其高表达与肿瘤的侵袭性关系密切，可以作为肿瘤侵袭性的一项指标。而且CD147与MMP-9过表达多同时出现，两者之间呈正相关，说明CD147与MMP-9的产生可能密切相关，在促进肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用。

　　肿瘤细胞从原位增殖到浸润、转移，其中包括基底膜降解、基质渗透以及肿瘤细胞进出血管和对靶组织的侵袭。所有这些都要求由蛋白水解酶介导的基底膜组成成分和细胞外基质大分子的重塑[9]。而在这些水解酶中，MMPs尤为重要。MMPs是一组结构和功能相关的锌离子依赖性内肽酶，具有降解各种细胞外基质成分的作用。目前已经明确的人类MMPs已有20多种 ,根据其作用底物和自身结构的不同可以分为6类。MMP-9归属于胶原酶IV，是金属蛋白酶家族中分子量最大的酶，是由多种细胞分泌的。MMP-9有广泛的底物，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶和弹性蛋白等，主要底物是Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶。IV型胶原是硬脑膜的关键成分，起硬脑膜屏障作用，能抵抗炎症或肿瘤造成的吸收和破坏。垂体腺瘤向周围正常组织侵袭性生长必须首先破坏硬脑膜。Kawamoto 等[10]研究发现，侵袭性垂体腺瘤中MMP-9的表达显著高于非侵袭性垂体腺瘤，而且IV型胶原在侵袭性垂体腺瘤中明显减少。有研究表明[2-3]，在MMPs的亚类中，MMP-9与垂体腺瘤的侵袭性关系最为密切。本研究从蛋白水平对MMP-9在垂体腺瘤中的表达进行研究，结果显示，侵袭性垂体腺瘤中MMP-9的表达水平明显高于非侵袭性垂体腺瘤组，更说明了MMP-9在肿瘤侵袭转移过程中的重要作用，因此认为，MMP-9可作为肿瘤侵袭性的一项指标。Turner等[11]发现，MMP-9表达阳性的垂体腺瘤的血管密度明显高于表达阴性的腺瘤，认为垂体腺瘤中血管生成与MMP-9表达有关。本结果显示，MMP-9与VEGF过表达多同时出现，相关分析亦表明两者之间呈正相关(r=0.781,P<0.01)，说明MMP-9与VEGF的产生密切相关，在促进肿瘤的侵袭转移过程中可能发挥了协同作用。两者的共同表达可作为血管发生的标志[12-13]。

　　肿瘤的生长、侵袭与转移需要足够的营养支持，血管的生长在这一过程中起到十分重要的作用。肿瘤的生长依赖于血管的生成，新生血管形成是肿瘤生长、侵袭与转移的必要条件之一。VEGF又名血管通透因子(Vascular Permeability factor，VPF)，是一种具有高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，是分子量为34～46 kD的二聚体糖蛋白。VEGF通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥多种生物学效应。此外，VEGF可改变内皮细胞的活化形式,上调尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)等的表达 ，刺激血管内皮的增生，这不仅可促进内皮细胞移动 ，促进新生血管的生成，而且还有利于肿瘤细胞脱落，并向血管或周围扩散，为肿瘤侵袭转移创造条件。这可能也是本实验结果显示的VEGF表达与垂体腺瘤侵袭性有关的最重要的理论基础，当然也不排除其它因素共同作用的结果。本实验结果显示，VEGF在侵袭性垂体瘤中的蛋白表达明显高于非侵袭组，表明垂体腺瘤的侵袭性在发生机制上与血管生成存在密切关系，VEGF也是垂体腺瘤侵袭性的分子生物学参考指标之一。本研究对侵袭性垂体腺瘤中的CD147及VEGF在蛋白表达水平进行相关分析，结果显示二者呈显著正相关(r=0.509，P<0.01)，这可能是CD147促进MMP-9的产生和分泌，MMP-9又促进VEGF产生的结果，或者CD147直接促进VEGF的产生，这种结果目前未见报道。对于MMP-9和VEGF之间的正相关，有作者认为[14-15]，VEGF能上调内皮细胞uPA的表达，uPA能激活纤溶酶并进而激活MMPs,此外,VEGF也能直接诱导MMPs的基因转录。这种正相作用在本实验结果中得到体现。

　　总之，本实验研究结果提示，CD147、MMP-9及VEGF的高表达与垂体腺瘤的侵袭性密切相关，三者可作为垂体腺瘤侵袭性的有效指标，并且共同促进垂体腺瘤侵袭性生长。上述指标不仅有助于指导侵袭性垂体腺瘤的临床诊断和治疗，也为侵袭性垂体腺瘤的分子生物学治疗提供了一定的理论基础。

　　【参考文献】

　　[1] Sun J, Hemler M E. Regulation of MMP-1 an MMP-2 production through CD147/extracelluar matrix metalloproteinase inducer interaction[J]. Cancer Res, 2001, 61(1):2276-2281

　　[2] Turner H E, Nagy Z, Esiri M M, et al. Roleofm atrix metalloproteinase -9 in pituitary tumor behavior[J]. J Clin Endocorinol Metab, 2000, 85(8):2931-2935.

　　[3] 王翦，刘运生.MMP及TIMP在垂体腺瘤中的表达及与侵袭性关系[J].湖南医科大学学报, 2004, 29(6):647-650.

　　[4] Veikkola T, Alitalo K. VEGF receptors and angiogenesis[J]. Semin Cancer Biol, 1999, 9(9):211-220.

　　[5] Wilson C B. A decade of pituitary microsurgery: The herbert olivercrona lecture[J]. J Nenurosury, 1984, 61(5):814-833.

　　[6] Knosp E, Steiner E, Kitz K, et al. Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space: a magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings[J]. Neurosurgery, 1993, 33(4):610-618.

　　[7] Guo H, Zucker M K, et al. Simulation of matrix metalloproteinase production by recombinant extracelluar matrix metalloproteinase inducer from transfected chinese hamster ovary cells[J]. J biol Chem, 1997, 272(1):24.

　　[8] Renno T, Wilson A, Dunkel C, et al. A role for CD147 in thymic development[J]. J Immun, 2002, 168(10):4946.

　　[9] 李存孝，范清宇.CD147结构和功能及其与肿瘤关系的研究进展[J].现代肿瘤医学，2005， 13(3):422-424.

　　[10] Kawamoto H, Uozumi T, Kamamtot K, et al. Type IV collagenase activity and cavenous sinus invasion in human pituitary adenomas[J]. Acta Neurochir(Wien), 1996, 138(4):390-395.

　　[11] Turner E, Kachra Z, Mousseau N, et al. Matrix mellalloproterinases and their inhibitors in human pituitary tumors[J]. Neurosurgery, 1999, 45(6):1432-1440.

　　[12] Riedel F,Gotte K,Schwalb J, et al. Expression of 92-kDa type IV collagenase correlates with angiogenic markers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma[J]. IntJOncol, 2000, 17(6):1099-1105.

　　[13] Iedel F, Gotte K, Bergler W, et al. Inverse correlation of apoptotic and angiogenic markers in squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Oncol Rep, 2001, 8(3):471-476.

　　[14] Kim I, Kim H G, Moon S O, et al. Angiopoietin-1 induces endothelial cells prouting through the activation of focal adhesion kinase and plasm inscretin[J]. Circ Res, 2000, 86(9):952-959.

　　[15] Fang J, Shing Y, Wiederschain D, et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to theangiogenic phenotypein tumor model[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(8):3884-3889.