脑胶质瘤组织中PCNA和PTEN表达的意义

　　作者：孟喜君,刘勇,王茂德,谢万福　　作者单位：西安交通大学医学院：第一附属医院神经外科，解剖与组织胚胎学，陕西 西安 710061

　　【摘要】 目的：探讨增殖细胞核抗原(PCNA)和第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)在脑胶质瘤组织中表达差异的临床意义. 方法：采用组织芯片技术建立96例脑胶质瘤和22例正常脑组织的组织芯片，并用免疫组织化学Elivision法，分别检测PTEN和PCNA在不同组织学类型和不同组织学分级的人脑胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异. 结果： PCNA和PTEN在脑胶质瘤组织中的表达与在正常脑组织中的表达之间的差别有显著意义; PTEN在星形细胞瘤中的表达阳性率45/78 (57.7%)显著高于其在非星形细胞瘤中的表达阳性率5/18 (27.8%)(P<0.05); PCNA在高分化脑胶质瘤(组织学分级Ⅰ～Ⅱ级)中表达低于在低分化脑胶质瘤(组织学分级Ⅲ～Ⅳ级)中表达;随着胶质瘤恶性度增高,PTEN表达强度逐渐下降,PCNA的表达则呈上升趋势. 结论：PCNA的表达反应了脑胶质瘤细胞增殖与分化的一般规律, PTEN表达的降低在脑胶质瘤的发生、发展过程中可能起着非常重要的作用，PCNA和PTEN的联合检测有利于更准确地判断胶质瘤生物行为和评估患者预后.

　　【关键词】 胶质瘤;增殖细胞核抗原;磷酸脂酶

　　Significance of PCNA and PTEN expressions in glioma tissue

　　MENG XiJun, LIU Yong, WANG MaoDe, XIE WanFu

　　Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital,Department of Anatomy and Histoembryology, Medical School, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the clinical significance of the differential expressions of PCNA and PTEN in glioma tissue and normal brain tissue. METHODS: Tissue microarray including 96 gliomas and 22 normal brain tissues was prepared. The expressions of PCNA and PTEN in glioma tissue and normal brain tissue with different histological types and different histological grades were detected by Elivision method of immunohistochemistry. RESULTS: The positive expression rates of PCNA and PTEN had significantly difference between glioma tissue and normal brain tissue (P<0.05). The expression of PTEN was significantly higher in astrocytoma than in other types of glioma (P<0.05); the expression of PCNA was significantly lower in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma, but the expression of PTEN was significantly higher in welldifferentiated glioma than in poorly differentiated glioma; along with the malignant level of glioma rising up, the expression intensity of PTEN decreased, and the expression of PCNA increased. CONCLUSION: The expression of PCNA mirrors the general rule of cell multiplication and differentiation of glioma. The decrease of the expression of PTEN may have very important effect on development and growth of glioma. Combined detection of PCNA and PTEN can estimate the biological behaviour and prognosis of the patients more exactly.

　　【Keywords】 glioma; PTEN; PCNA

　　0 引言

　　脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤之一，随着肿瘤级别的增加，其恶性度也加大，对于恶性胶质瘤目前尚无有效的治疗手段，如何提高胶质瘤患者的生存率一直是神经外科界迫切需要解决的难题. 我们采用免疫组织化学方法，观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)在不同性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型和组织学分级的脑胶质瘤和正常脑组织中的表达情况. 探讨脑胶质瘤组织中PCNA和PTEN表达的意义，旨在从蛋白水平研究脑胶质瘤的发病原因，为临床寻找脑胶质瘤的病因提供理论参考和依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 1997/2005西安交通大学医学院第一附属医院脑胶质瘤存档蜡块96(男45，女51)例;年龄14～77(平均46.5)岁，其中≤45岁者56例，>45岁者40例. 参照《WHO(1999)神经系统肿瘤分类》标准进行组织学分型和分级，星形细胞瘤78例，节细胞胶质瘤4例，恶性室管膜瘤6例，室管膜母细胞瘤2例，少突胶质细胞瘤4例，促纤维增生形细胞瘤2例;Ⅰ级胶质瘤19例，Ⅱ级胶质瘤28例，Ⅲ级胶质瘤29例，Ⅳ级胶质瘤20例;胶质瘤≤4 cm者34例，>4 cm者62例. 另外取正常脑组织22例作为对照. 全部标本经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，复查HE切片，在HE切片上找到肿瘤细胞伏击的区域并对照蜡块的相应的位置作标记，确定取材位点. 用制备组织芯片的空心蜡模模具制作内径为2 mm的空心蜡模. 用内径为2 mm的组织芯片取样器在蜡块的标记位点取出组织蜡芯，并将其轻放入空心蜡模的孔中，按照一定的顺序安放所有的肿瘤组织蜡芯，制作成组织微阵列并对组织芯片蜡块进行4 μm连续切片，裱褙于APES防脱片胶预处理的载玻片上，待行免疫组织化学染色.

　　1.2 方法 免疫组织化学染色操作流程参照Elivision说明书，一抗PCNA抗体稀释浓度为1∶80，PTEN抗体稀释浓度为1∶20，二抗酶标羊抗鼠/兔聚合物，DAB显色，苏木素复染， 以PBS替代一抗作为阴性对照, 用已知PCNA和PTEN阳性的前列腺癌切片作阳性对照. PCNA阳性结果为肿瘤细胞细胞核染成棕黄色或者棕褐色. 参考文献[1]的标准，以图像分析仪双盲法阅片, 每个标本观察200倍光镜下视野，每个视野记数100个细胞根据PCNA阳性细胞占肿瘤细胞百分率,将其分为4级:Ⅰ级:1%～25%;Ⅱ级:26%～50%; Ⅲ级:51 %～75%;Ⅳ级:>75%. 其中Ⅰ～Ⅱ级为弱阳性(+),Ⅲ～Ⅳ级为强阳性(). PTEN以肿瘤细胞细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性. 参考文献[2]的标准，按染色强度评分: 0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色. 再按阳性细胞所占的百分比评分:0分为阴性,1 分为阳性细胞≤10%, 2分为11%～50%, 3分为51%～75%, 4分为>75%; 染色强度与阳性细胞百分比的乘积: 9～12分为强阳性(),5～8分为弱阳性(+),0～4 分为阴性(-).

　　统计学处理: 采用SPSS 11.0统计学软件进行数据处理，采用χ2检验和Spearman相关分析，分析PTEN蛋白和PCNA抗原的表达与各临床，病理指标的相互关系.

　　2 结果

　　2.1 脑胶质瘤组织PCNA和PTEN的表达 脑胶质瘤组织PCNA的表达阳性率为67.7%(65/96)，正常脑组织为9.1%(2/20)，差异显著(P<0.01);脑胶质瘤组织PTEN的表达(E,F)阳性率为52.1%(50/96)，正常脑组织为95.5%(21/22)，差异显著(P<0.01). PCNA的表达与组织学分型和分级有关

　　2.2 PTEN表达与组织分化程度的关系 PTEN在高分化脑胶质瘤(组织学分级Ⅰ～Ⅱ级)组织中表达阳性率为68.1%(32/47), 高于在低分化脑胶质瘤(组织学分级Ⅲ～Ⅳ级)组织中表达阳性率36.7%(18/49)，差异有统计学意义(P<0.01). 在脑胶质瘤患者中随着组织学分级的升高，PTEN的表达量呈下降趋势. PTEN在星形细胞瘤中的表达阳性率57.7%(45/78)，与PTEN在非星形细胞瘤中的表达阳性率27.8%(5/18)比较，差异有统计学意义(P<0.05).

　　脑胶质瘤组织PCNA和PTEN的阳性表达

　　胶质瘤组织学分级和分型与PCNA和PTEN表达

　　I～ II级与III～IV级比较：χ2=14.8412，P=0.0001;χ2=9.4477，P=0.0021; 星形细胞瘤与非星形细胞瘤比较：χ2=0.2065，P=0.6496; χ2=5.2441，P=0.0220.

　　3 讨论

　　大多数肿瘤的发生和发展都由多种肿瘤相关基因改变引起,了解更多肿瘤发生和发展的生物学基础, 找到用于肿瘤诊断、评价预后和治疗的肿瘤标记物, 对于研究肿瘤是十分重要的. Kononen等[3]首先提出组织芯片的概念, 已成为研究基因与基因产物的重要工具. PCNA是Kononen等[4]首先发现并命名，在细胞增殖过程中起重要作用，是评价细胞增殖状态的重要指标. 我们发现，96例胶质瘤中有65例PCNA阳性表达(67.7%，65/96)，明显高于正常脑组织(9.1%，2/22，P<0.05). 导致PCNA的高表达率主要是由于PCNA的半衰期约20 h,刚离开周期的细胞中仍能测到残留的未降解的PCNA蛋白[5]. 而且PCNA在DNA修复和(或)在非周期细胞的生长因子的作用下可能有选择性的PCNA表达[6]. 我们发现，47例Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤中PCNA阳性率为48.9%(23/47)，49例Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中PCNA阳性率高达85.7%(42/49),Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中阳性率显著高于Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤(P<0.05);并且PCNA与脑胶质瘤的组织学分级呈正相关关系(r=0.494, P<0.05). 因此我们认为，PCNA的过度表达导致了细胞周期调节紊乱,影响胶质瘤的增殖和分化, 参与了胶质瘤的恶性进展，它的表达与胶质瘤的恶性行为相关. PCNA阳性的肿瘤细胞分布不均匀，不同区域或不同恶性程度的肿瘤阳性细胞数差异很大. 一方面说明胶质瘤具有异质性，同一肿瘤内不同区域的肿瘤细胞的生物特性不尽相同.

　　PTEN是一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，与蛋白酪氨酸磷酸酶同源，该基因定位于染色体q23.3，在多个进展期肿瘤有突变[6]. Hamada等[7]研究发现,PTEN基因突变主要出现在组织恶性程度高，组织学更具侵袭性的胶质瘤中，而在组织恶性程度低的胶质瘤中极少存在,从而推测PTEN基因突变与由低度恶性向高度恶性过渡有关. Dickerson等[8]发现, PTEN突变、缺失在原发性恶性胶质瘤中更为常见, PTEN基因在高级别的胶质瘤中表达率低于低级别的胶质瘤,从而证明PTEN失表达在胶质瘤恶性进展中起重要作用. 我们发现, PTEN的表达与胶质瘤的组织学分型有关，在星型细胞瘤中的表达阳性率与其在非星型细胞瘤中的表达阳性率比较(P<0.05). PTEN在脑胶质瘤Ⅲ，Ⅳ级组织内的表达显著低于Ⅰ，Ⅱ级，随着组织学分级的升高，PTEN的表达呈下降趋势,说明PTEN的表达随胶质瘤组织恶性程度的变化而改变, 即胶质瘤组织学分级越高其表达水平越低,证明该基因的失活在胶质瘤的恶性阶段最为明显,PTEN的低表达可能促进了肿瘤组织由高分化向低分化演进的过程，提示该基因与胶质瘤的演化及侵袭进程关系密切，PTEN表达下调的脑胶质瘤更具有恶性表型和恶性行为. 本研究结果显示，组织学分级越高,年龄越大,PTEN蛋白的表达越低,提示PTEN基因的失活参与了胶质瘤的发生，可能与胶质瘤恶性进展及患者预后有关.

　　【参考文献】

　　[1] 赖建生，夏 强，张孝斌，等. 增殖细胞核抗原和p27在前列腺增生和前列腺癌组织中的表达及意义[J]. 中华肿瘤杂志，2004, 26(8): 476-478.

　　[2] Salvesen HB, Stefansson I, Kalvenes MB, et al. Loss of PTEN expression is associated with metastatic disease in patients with endometrial carcinoma [J]. Cancer, 2002, 94(8): 2185-2191.

　　[3] Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for highthroughputmolecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med, 1998, 4(7): 844-847.

　　[4] Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue microarrays for highthroughputmolecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med, 1998, 4(7): 844-847.

　　[5] Suzuki A, Kaisho T, Ohishi M, et al. Critical roles of PTEN in B cell homeostasis and immunoglobulin class switch recombination[J].J Exp Med, 2003, 197(5): 657-667.

　　[6] Kayaselcuk F, Zorludemir S, Gumurduhu D, et al. PCNA and Ki67 in central nervous system tumors: correlation with the histological type and grade[J]. J Neurooncol, 2002, 57(2): 115-121.

　　[7] Hamada K, Sasaki T, Koni PA, et al. The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis[J]. Genes Dev, 2005, 19(17): 2054-2065.

　　[8] Dickerson EB, Thomas R, Fosmire SP, et al. Mutations of phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10 in canine hemangiosarcoma[J]. Vet Pathol, 2005, 42(5): 618-632.