颅脑损伤早期水通道蛋白4表达的临床研究

　　作者：陈宝智,赵建农,黄垂学,刘朝晖,王宇田　　作者单位：海南省人民医院神经外科，海南 海口　570311

　　【摘要】目的：研究颅脑损伤24h内水通道蛋白4(AQP4)的表达变化与颅脑损伤的伤情程度和伤后时间的关系。方法：39例颅脑损伤24h内患者，按照GCS评分分为3组：轻中型颅脑损伤(GCS 9～15分)11例，重型颅脑损伤(GCS 6～8分)13例，特重型颅脑损伤(GCS 3～5分)15例，以上3组再根据伤后距手术时间不同分为≤ 6 h、6～12 h和>12 h 各3组;手术中取损伤区脑组织标本，用免疫组化方法检测AQP4的表达。结果：伤情程度越重，AQP4的表达量越大;随着伤后时间的延长，AQP4表达量逐渐增多。各组进行析因分析，伤情程度各组差异有统计学意义(F=3.686，P<0.05);不同时间段各组差异也有统计学意义(F=3.794，P<0.05)。结论：颅脑损伤后24h内，伤情程度越重，损伤时间越长，AQP4表达量越多。

　　【关键词】 颅脑损伤;水通道蛋白4;免疫组化

　　[ABSTRACT] Objective： To investigate the changes in AQP4 expression after traumatic brain injury (TBI)， and its correlation with the severity and progress of the injury. Methods： A total of 39 patients with TBI occurred within 24 hours were assigned into three groups based on the Glasgow Coma Scale(GCS) scores： mild to moderate (GCS 9-15) group (11 cases)，severe (GCS 6-8) group(13 cases)and critical severe (GCS 3-5 ) group (15 cases). Then each group was divided into three subgroups according to post-injury time which was ≤6 h ， 6-12 h ， and>12 h . The morphological changes of the brain specimens were observed with electron microscope. The expressions of AQP4 were detected with immunohistochemistry. Results： The expression of AQP4 in the cytoplasm and cytomembrane increased with the severity TBI and post-injury time. AQP4 expression was significantly different among the three groups (F=3.686，P<0.05). significant difference was also observed among subgroups (F=3.794，P<0.05). Conclusions： The expression of AQP4 increased with severity and post-injury time after TBI during the first 24 hours.

　　[KEY WORDS] Traumatic brain injury; Aquaporin 4; Immunohistochemistry

　　脑水肿是颅脑创伤后普遍存在的病理过程。目前的研究认为水通道蛋白4(aquaporin，AQP4)在脑水肿的发生中担当重要的角色[1]。本文着重于研究颅脑损伤的早期，伤情程度和损伤时间对损伤区脑组织AQP4表达的影响，现报道如下。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　脑组织标本来自2007年10月～2009年10月在海南省人民医院因创伤性颅脑损伤24 h内开颅手术所获取的挫伤脑组织，共39例，其中男性29例，女性10例。年龄15～77岁，平均48.6岁。致伤原因：车祸22例，打击7例，坠落5例，摔伤5例。术前按照格拉斯哥(GCS)评分评判颅脑损伤的伤情程度，将39例脑损伤患者分为3组：轻中型颅脑损伤组(GCS 评分9～15分)11例，重型颅脑损伤组(GCS评分6～8分)13例，特重型颅脑损伤组(GCS评分3～5分)15例;此3组患者分别根据伤后距手术时间不同再各分为3组：伤后 ≤ 6h组、6～12 h组、>12 h组。

　　1.2　方法

　　1.2.1　标本处理及主要试剂

　　脑组织标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚3 μm。AQP4即用型试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2.2　免疫组化检测AQP4的表达

　　切片常规脱蜡至水，用3%H2O2灭活内源性酶，热修复抗原，滴加AQP4抗体(一抗)，稀释度为1∶25,4 ℃孵育过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG ，冲洗后，滴加试剂SABC， DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察，胞膜膜浆中染有棕黄色为AQP4表达。同时用PBS代替一抗，结果胞膜膜浆均无染色。

　　1.2.3　图像分析

　　用40×10倍照相显微镜进行图像采集并做定量分析。以细胞平均光密度值(optical density， OD)表示AQP4的表达量。

　　1.3　统计学处理：

　　数据以均数±标准差(x-±s)表示，采用析因设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　损伤区脑组织超微结构变化

　　轻中型脑损伤组中，损伤区星形胶质细胞、血管内皮细胞轻度肿胀，毛细血管基底膜完整;在重型、特重型颅脑损伤组中，神经细胞肿胀明显加重，胶质细胞核膜不清，核仁边集，线粒体肿胀，溶酶体增多，细胞器空泡样变，血管内皮细胞肿胀明显，星形胶质细胞足突与毛细血管基底膜分离，甚至基底膜连续性中断，血管周围间隙明显扩大，血脑屏障受损严重。　重型、特重型颅脑损伤组损伤区脑组织超微结构变化(×3000)

　　2.2　不同伤情程度的颅脑损伤损伤区脑组织AQP4的表达

　　损伤区脑组织中细胞膜、细胞浆染呈棕黄色，为AQP4表达;AQP4表达量在特重型、重型颅脑损伤组较在轻中型组明显增多(F=3.686，P<0.05)。损伤区脑组织细胞胞膜、胞浆见棕黄色(AQP4阳性产物)(×400)

　　2.3　不同时间段的颅脑损伤损伤区脑组织AQP4表达

　　AQP4在伤后6h内即可见到表达，随着伤后时间的延长，AQP4表达量呈逐渐增多趋势，不同时间段各组AQP4表达差异亦有统计学意义(F=3.794，P<0.05)。不同伤情程度的颅脑损伤损伤区脑组织AQP4的表达

　　3　讨论

　　水通道蛋白家族(aquaporins)是一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，AQP4是其家族的一员，广泛存在于中枢神经系统中，尤其是在星形胶质细胞足突中，靠近基底膜处含量最丰富，这种分布特点提示AQP4是水分子在细胞内外、血管和脑组织之间运转的重要结构基础，参与脑组织水的代谢[2,3]。

　　Sun等[4]发现大鼠颅脑创伤后24 h，创伤区域脑组织AQP4 mRNA表达增多，而该区域脑组织水肿最严重，但毗邻损伤区脑组织AQP4 mRNA的表达下调。张琳等[5]在大鼠脑损伤模型中发现，从伤后1h到24h，损伤区星形胶质细胞AQP4表达逐渐增多，24 h达高峰，AQP4表达变化的时间与脑组织水含量变化一致，而反映血脑屏障(BBB)通透性标志物IgG的表达高峰又先于AQP4，其推测脑损伤后先出现BBB破坏，血管源性脑水肿形成，继而激活星形胶质细胞AQP4表达。以上的研究表明AQP4在创伤性脑损伤后脑水肿的形成中起重要作用。AQP4表达的调控受多因素影响，其中PKC途径中的磷酸化是主要影响因素之一[6]。

　　GCS被广泛用做颅脑损伤伤情程度的评估标准，评分越低，颅脑损伤的伤情程度越重。李良平等[7]在大鼠脑损伤模型实验中，通过检测EB定量，发现脑损伤程度与血脑屏障破坏呈正相关。Wolburg等[8]认为AQP4是血脑屏障的重要组成，血脑屏障的破坏程度与AQP4表达上调密切相关。本研究结果显示，颅脑损伤伤情程度越重，损伤时间越长，损伤区脑组织AQP4的表达越多，推测伤情程度和损伤时间影响损伤区脑组织BBB的完整性，继而促进脑组织的水肿。

　　【参考文献】

　　1　Papadopoulos MC， Verkman AS. Aquaporin-4 and brain edema[J]. Pediatr Nephrol， 2007， 22(6)：778-784.

　　2　Badaut J， Lasbennes F， Magistretti PJ， et al. Aquaporins in brain ： distribution， physiology， and pathophysiology[J]. J Cereb Blood Flow Metab， 2002， 22(4)：367-378.

　　3　Nielsen S ， Nagelhus EA， Amiry- Moghaddam M， et al. Specialized membrane domains for water transport in glial cells： high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain[J]. J Neurosci,1997， 17(1)： 171-180.

　　4　Sun MC， Honey CR， Berk C， et al. Regulation of aquaporin-4 in a traumatic brain injury model in rats[J]. J Neurosurg,2003， 98(3)： 565-569.

　　5　张琳，袁芳.大鼠脑外伤诱导水通道蛋白4表达增强加重脑水肿[J].首都医科大学学报，2008,29(6)：732-736.

　　6　Zelenina M， Zelenin S， Bondar AA， et al. Water permeability of aquaporin-4 is decreased by protein kinase C and dopamine[J]. Am J Physiol Renal Physiol， 2002， 283(2)：309-318.

　　7　李良平，徐如祥，钟世镇. 大鼠脑损伤后血脑屏障变化的定量研究[J].第一军医大学学报，1998,18(4)：252-253.

　　8　Wolburg H， Noell S， Wolburg-Buchholz K，et al. Agrin，aquaporin-4，and astrocyte polarity as an important feature of the blood-brain barrier[J]. Neuroscientist， 2009,15(2)：180-193.